Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie
Summary
Autophagie ist ein allgegenwärtiges Prozess, Zellen zu zersetzen und zu recyceln Proteine und Organellen ermöglicht. Wir bieten fortschrittliche Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren und zu quantifizieren, die klein, aber wichtig, körperliche Veränderungen mit der Induktion von Autophagie verbunden sind, einschließlich der Bildung und Verteilung von Autophagosomen und Lysosomen, und deren Verschmelzung zu autolysosomes.
Abstract
Prostatakrebs ist die führende Form von malignen Erkrankungen bei Männern in den USA Während der Operation trägt ein erhebliches Risiko von Impotenz und Inkontinenz, haben traditionelle chemotherapeutische Ansätze weitgehend erfolglos. Hormontherapie ist in einem frühen Stadium wirksam, aber oft nicht mit dem späteren Entwicklung von Hormon-resistentem Tumoren. Wir haben in die Entwicklung von Therapeutika für bestimmte metabolische Mangel von Tumorzellen interessiert. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Prostata-Tumorzellen spezifisch fehlt ein Enzym (Argininosuccinatsynthase oder ASS) für die Synthese der Aminosäure Arginin 1 beteiligt. Dieser Zustand bewirkt, dass die Tumorzellen abhängig zu werden exogenen Arginin, und sie unterziehen metabolischen Stress, wenn der freie Arginin durch Arginindeiminase (ADI) 1,10 aufgebraucht ist. In der Tat haben wir gezeigt, dass die menschliche Prostata-Krebszellen CWR22 Rv1 effektiv durch ADI mit Caspase-unabhängige Apoptose und aggressive autopha getötetgy (oder Makroautophagie) 1,2,3. Autophagie ist ein evolutionär konservierten Prozess, Zellen zu verstoffwechseln unerwünschte Proteine durch lysosomalen Abbau während Ernährungs Hunger 4,5 ermöglicht. Obwohl die wesentlichen Komponenten dieses Weges gut charakterisierten 6,7,8,9 sind, sind viele Aspekte der molekularen Mechanismus noch unklar – insbesondere, was ist die Rolle der Autophagie in den Tod-Reaktion von Prostata-Krebszellen nach Behandlung ADI ? Um diese Frage zu beantworten, benötigten wir ein experimentelles Verfahren, um das Niveau und den Umfang der autophagic Reaktion in Zellen zu messen – und da es keine bekannten molekularen Markern, die genau verfolgen können diesen Prozess sind, entschieden wir uns für ein bildgebendes Ansatz zu entwickeln, mit quantitative 3D Fluoreszenzmikroskopie 11,12.
Mit CWR22Rv1 Zellen mit fluoreszierenden Sonden für Autophagosomen und Lysosomen speziell markierten, zeigen wir, dass 3D-Bild Stapel entweder mit wi erworbendefield Entfaltung Mikroskopie (und später, mit Super-Auflösung, strukturierte Illumination Microscopy) eindeutig erfassen die frühen Phasen der Autophagie Induktion. Mit kommerziell verfügbaren digitalen Bildanalyse, können wir leicht zu bekommen statistische Informationen über Autophagosom und Lysosomen Anzahl, Größe, Verteilung und Grad der Kolokalisation von jedem abgebildeten Zelle. Diese Informationen ermöglichen es uns, genau zu verfolgen den Fortschritt der Autophagie in lebenden Zellen und ermöglicht unseren fortgesetzten Untersuchung in die Rolle der Autophagie in Krebs-Chemotherapie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während die direkte Beobachtung von Zellen mit fluoreszierenden Sonden gegen LC3 beschriftet wird weithin als Standard-Methode, um autophagic Antwort 6, quantitative 3D-Bildgebung des gleichen Systems (wie wir getan haben) bietet beispiellose Informationen und Details über den komplexen Prozess der zellulären Autophagie bestätigen akzeptiert . Insbesondere beobachten wir, dass Hunderte (wenn nicht Tausende) von Autophagosomen in lebenden Zellen innerhalb von 80 min Induktion der Autophagie gebildet werden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Zuschüsse: NIH CA165263, CA150197 NIH, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0120999 Zentrum für Biophotonik Science & Technology (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Bold), das Forschungszentrum Council of Norway, Leiv Eiriksson Reisestipendium 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung erkennt auch die Unterstützung der Gemeinschaft Auburn Cancer Endowment Fund. RJ Bold erkennt auch die Unterstützung der J. McDonald Stiftung.
Wir danken Dr. Jenny Wei-Jen Kung und Dr. Bor-wen Wu bei DesigneRx für die großzügige Bereitstellung von ADI.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
| Saponin | Sigma | S4521 | |
| Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |
References
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