Modificación genética y recombinación de las Glándulas Salivales culturas de órganos

Summary

Una técnica para manipular genéticamente las células epiteliales dentro de toda<em> Ex vivo</em> Cultivadas de embriones de ratón glándulas submandibulares (SMG) con transferencia génica viral se describe. Este método se aprovecha de la capacidad innata de SMG epitelio y el mesénquima para recombinarse espontáneamente después de la separación y la infección de rudimentos epiteliales con vectores adenovirales.

Abstract

La morfogénesis de ramificación se produce durante el desarrollo de muchos órganos, y la glándula submandibular del ratón embrionario (SMG) es un modelo clásico para el estudio de la morfogénesis de ramificación. En la SMG desarrollo, este proceso implica pasos iterativos de brote epitelial y la formación del conducto, en última instancia, para dar lugar a una compleja red ramificada de acinos y conductos, que sirven para producir y modificar / transportar la saliva, respectivamente, en la cavidad oral de ^{1 – 3.} La membrana basal epitelial asociada y los aspectos de la compartimiento mesenquimal, incluyendo las células del mesénquima, factores de crecimiento y la matriz extracelular, producidas por estas células, son críticos para el mecanismo de ramificación, aunque la forma de los acontecimientos celulares y moleculares están coordinados sigue siendo poco conocida ⁴ . El estudio de los mecanismos moleculares de conducción avances epiteliales morfogénesis nuestra comprensión de los mecanismos de desarrollo y da una idea de posible regeneraraproximaciones creativas medicina. Tales estudios se han visto obstaculizados por la falta de métodos eficaces para la manipulación genética del epitelio salival. Actualmente, la transducción adenoviral representa el método más eficaz para atacar a las células epiteliales de las glándulas adultos in vivo ^5. Sin embargo, en los explantes de embriones, mesénquima y densa de la membrana basal que rodea las células epiteliales impide el acceso viral a las células epiteliales. Si el mesénquima se retira, el epitelio puede ser transfectadas utilizando adenovirus, y rudimentos epiteliales puede reanudar la morfogénesis de ramificación en presencia de Matrigel o laminina-111 ^6,7. Mesénquima crecimiento libre de rudimento epitelial también requiere suplementos adicionales con factores de crecimiento solubles y no completamente recapitular la morfogénesis de ramificación ya que se produce en las glándulas intactas ^8. Aquí se describe una técnica que facilita la transducción adenoviral de las células epiteliales y la cultura de la e transfectadaspithelium con mesénquima asociado. Después de la microdisección de los subfusiles embrionarias, la eliminación de la mesénquima, y ​​la infección viral del epitelio con un adenovirus que contiene GFP, se muestra que el epitelio espontáneamente recombina con mesénquima no infectada, recapitulando intacta la estructura glandular SMG y la morfogénesis de ramificación. La población de células epiteliales modificadas genéticamente pueden controlarse fácilmente utilizando métodos estándar de microscopía de fluorescencia, si fluorescentemente etiquetados construcciones adenovirales se utilizan. El método de recombinación de tejidos descrito aquí es actualmente el método más eficaz y accesible para la transfección de células epiteliales con un vector de tipo salvaje o mutante dentro de una construcción de tejido complejo 3D que no requiere la generación de animales transgénicos.

Protocol

El protocolo contiene cuatro etapas principales, como se representa en la figura 1. Todos los pasos se describen con todo detalle. Construcción de adenovirus y la purificación viral se debe realizar antes de la extracción de órganos para su uso en la transducción genética de diseccionados rudimentos epiteliales. Todos los estándares BSL-2 medidas de seguridad se deben seguir cuando se trabaja con adenovirus. 1. Embrionarias de ratón glándula submandibular (SMG) Recole…

Representative Results

El flujo de las etapas experimentales principales se describen en la Figura 1. Un ejemplo de un SMG intacto, un rudimento epitelial aislado, y su mesénquima correspondiente se muestra en la Figura 2. Imágenes de campo claro subfusiles recombinados, que siguen a someterse a la morfogénesis de ramificación cuando cultivadas ex vivo durante los tiempos indicados, se muestran en la Figura 3. Glándulas recombinados cultivadas durante 48 horas epitelial que expr…

Discussion

El ex vivo epitelial-mesenquimal técnica de recombinación fue publicado por primera vez por las glándulas salivales submandibulares en 1981 ^16. En este protocolo, se expanda en el método original, usando infección adenoviral para manipular la expresión génica de células epiteliales en el contexto de una glándula recombinado. Se demuestra que un porcentaje de las células epiteliales están infectadas con el adenovirus, mientras que el porcentaje de células que están infectadas depende de l…

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/Ham’s F12 Medium without phenol red	Life Technologies	21041-025
Penicillin and Streptomycin	Life Technologies	15070-163	10X stock
Dispase	Life Technologies	17105-041	Freeze single use aliquots at -20C
BSA	Sigma	A2934-100G	Fraction V, low endotoxin
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Should be high titer (1×1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay.
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v)
1X Phosphate-buffered saline (PBS)	Life Technologies	70011-044	Prepared from 10X stock
Hank’s Balanced Salt Solution	Life Technologies	14175095	no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red
Transferrin	Sigma	T8158	25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C
L- Ascorbic acid (Vitamin C)	Sigma	A4403	75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C
			Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol.
10 cm sterile plastic dishes	Corning	430167	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo dissecting microscope with transmitted light base	Nikon	SMZ645	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
35 mm tissue culture dishes	Falcon	353001	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm diameter microwell dishes	MatTek Corporation	P50-G-1.5-14F
Nuclepore Track-Etch membrane filters	Whatman	110405	13 mm diameter, 0.1 mm pore size
Widefield fluorescence microscope	Carl Zeiss, USA	Axio Observer Z1	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SP5	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR	Charles River Labs		Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0).
Scalpel blade #11	Fine Science Tools	10011-00
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	10003-12
Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm	Fine Science Tools	11252-20	Ideal for harvesting glands from embryos
Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm	Fine Science Tools	11295-20	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
			Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol.