Lymphocytes T exprimant un récepteur CD19 chimérique antigène spécifique (RCA) sont infusés comme traitement expérimental des cellules B malignes dans nos first-in-humains essais de thérapie génique. Nous décrivons la modification génétique des cellules T en utilisant le<em> Belle au Bois Dormant</em> (SB) Système d'introduire CD19 spécifique CAR et la propagation sélective au designer CD19 + cellules présentant l'antigène artificielles.
La puissance des cellules T de qualité clinique peut être améliorée en combinant la thérapie génique avec une immunothérapie pour concevoir un produit biologique avec un potentiel de qualité supérieure (i) la reconnaissance des antigènes associés aux tumeurs (TAA), (ii) la persistance après la perfusion, (iii) possibilité de migration vers des sites tumoraux, et (iv) la capacité de recycler les fonctions effectrices dans le microenvironnement de la tumeur. La plupart des approches de la manipulation génétique de cellules T modifiées pour une application humaine ont utilisé des rétrovirus et des lentivirus pour l'expression stable de la RCA 1-3. Cette approche, bien que conforme aux bonnes pratiques de fabrication (BPF), peut être coûteuse car elle repose sur la fabrication et la libération de qualité clinique virus recombinant à partir d'un nombre limité de sites de production. Le transfert de plasmides électro-non viraux est une alternative intéressante à la transduction depuis espèces d'ADN peuvent être produites au grade clinique à environ 1/10 ème du coût de recombinant de qualité GMP virus. Pour améliorer l'efficacité de l'intégration, nous avons adapté Sleeping Beauty (SB) transposon et la transposase de l'homme 4-8 application. Notre système SB utilise deux plasmides d'ADN qui se composent d'un transposon codant pour un gène d'intérêt (par exemple génération nd 2 transgène CAR-CD19 spécifique, désigné CD19RCD28) et une transposase (par exemple SB11) qui insère le transgène dans dinucléotide TA répète 9-11 . Pour générer des nombres suffisants de cliniquement génétiquement modifiés cellules T K562 nous utilisons des cellules dérivées présentatrice d'antigène artificielle (VAMP) (clone n ° 4) modifiée pour exprimer un TAA (par exemple CD19), ainsi que des molécules co-stimulatrices des cellules T CD86, CD137L, un membranaire version de l'interleukine (IL) -15 (peptide fusionné à jour IgG4 région Fc) et CD64 (Fc-γ du récepteur 1) pour le chargement des anticorps monoclonaux (AcM) 12. Dans ce rapport, nous démontrons les procédures qui peuvent être mises en compliance avec cGMP pour générer CD19 spécifique CAR + cellules T appropriées pour une application humaine. Ceci a été réalisé par le synchrone électro-transfert de deux plasmides d'ADN, un transposon SB (CD19RCD28) et une transposase SB (SB11), suivie par la récupération des intégrants stables par les ajouts tous les-7-jours (cycle de stimulation) de γ-irradiés aAPC (clone n ° 4), en présence d'IL-2 soluble humaine recombinante et de l'IL-21 13. Typiquement 4 cycles (28 jours de culture en continu) sont entrepris pour générer des nombres cliniquement intéressantes de cellules T qui expriment de manière stable la RCA. Cette méthode de fabrication de qualité clinique CD19 des cellules T spécifiques peuvent être appliquées à des cellules T dérivées du sang périphérique (PB) ou de sang de cordon ombilical (UCB). En outre, cette approche peut être mise à profit pour générer des cellules T à divers types de tumeurs en jumelant la spécificité de la RCA a présenté à l'expression de l'ANT, reconnu par la République centrafricaine, le aAPC.
Transposon et la transposase systèmes, tels que des piggyBac 12,19 et SB 18,20-22, sont non viraux approches de thérapie génique qui sont une alternative à la médiation virale transduction de la RCA de qualité clinique cellules T. Le SB a été choisi comme système de transfert génique basée sur son potentiel pour la thérapie génique humaine 1,6,23. Nous avons développé des technologies duales de transposition SB (à introduire un CAR) et l'addition récursive de γ-irradiés aAPC (pour récupérer les cellules T génétiquement modifiés exprimant de façon stable un RCA) pour servir de plates-formes technologiques dans la fabrication de cellules T ANT spécifiques dans le respect avec cGMP pour la phase I / II des essais (figure 4). Au bout de 28 jours (quatre cycles de stimulation de 7 jours) de co-culture sur γ-irradiés aAPC, nous sommes généralement en mesure de générer au moins ~ 10 10 cellules génétiquement modifiées T conviennent à des applications humaines. Au besoin, les cycles de stimulation supplémentaires peuvent être entrepris to générer un plus grand nombre de lymphocytes T génétiquement modifiés. En outre, si moins CAR + cellules T sont nécessaires, l'approche de l'électroporation et de propagation peut être réduit en utilisant moins de cuvettes et de report juste un sous-ensemble de cellules T développées numériquement pour les rondes subséquentes de la prolifération des aAPC au début de chaque cycle de stimulation. La majorité de la électroporation et propagé les cellules T récoltées pour perfusion exprimer de manière stable la RCA. L'excroissance de cellules CD4 + et CD8 + exprimant notre 2 ème génération CAR comprennent les cellules présentant un phénotype de mémoire / naïve et présentent trois caractéristiques de la re-dirigé spécificité. Tout d'abord, les cellules T génétiquement modifiés spécifiquement lyser des cibles CD19 +, d'autre part, de produire de l'IFN-γ en réponse à CD19 + cellules stimulatrices et, troisièmement, prolifèrent en réponse à CD19 + cellules nourricières, tous d'une manière dépendante de la RCA 13,18. Notre approche de l'intégrmangé un transgène VOITURE par électro-transfert de plasmides d'ADN non viraux du système SB peut être entrepris dans les cellules T quiescentes primaires dérivées de PB et UCB. Nous et d'autres ont modifié génétiquement des cellules K562 pour servir aAPC d'envoyer efficacement les numéros clinique suffisant de cellules T à diluer pour perfusion 24,25. Le aAPC et de l'environnement de culture tissulaire (par exemple, l'addition d'IL-21) ont été ont été modifiés afin de générer le patient et le donneur dérivé CD19 des cellules T spécifiques pour perfusion après de cellules souches hématopoïétiques transplantation (tableau 1) 13,18. Nous pouvons produire CAR + cellules T PB simplement obtenu par ponction veineuse qui évite le coût, l'inconfort et les inconvénients de l'obtention MNC du PB par aphérèse. La capacité à tirer un grand nombre de CAR + cellules T de petits nombres de MNC est particulièrement attrayante pour injecter des cellules T allogéniques après la transplantation UCB. La petite taille et l'anonymat du donneur néonatale empêche re-Accéder à cet individu à un moment plus tard et seulement un nombre limité d'récolté MNC sont disponibles comme matière première pour la fabrication de cellules T pour éviter d'interférer avec l'hématopoïèse. De nouveaux progrès dans le processus de fabrication sont actuellement en cours afin d'inclure un dispositif d'électroporation à haut débit couplé à un bioréacteur WAVE complètement fermée à minimiser la manipulation. Dans l'ensemble, le SB et aAPC font appel à générer des plates-formes CD19 spécifique CAR + cellules T qui peuvent être adaptées pour produire un grand nombre de lymphocytes T génétiquement modifiés qui peuvent reconnaître d'autres cellules de surface TAA en conformité avec les normes cGMP.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Carl Juin (Université de Pennsylvanie) pour la génération et la fourniture de l'aide clone aAPC n ° 4 et le Dr Perry Hackett (Université du Minnesota) à l'aide du système SB.
Les subventions: Cancer Center de base Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); SPORE (CA136411), Albert J Ward Fondation Burroughs Wellcome Fund; Gillson Longenbaugh Fondation de prévention du cancer Institut de recherche et du Texas; CLL Global Research Foundation, le ministère de la Défense; succession de Noelan L. Bibler, Harry T. Mangurian, Jr., Fonds pour l'immunothérapie leucémie, l'Institut de la thérapie du cancer personnalisé, Société de leucémie et lymphome; Lymphoma Research Foundation; MDACC Soeur Institution Réseau Fonds; Miller Foundation; M. Herb Simons, M. et Mme Joe H. Scales, M. Thomas Scott, Fondation nationale pour la recherche sur le cancer; Pediatric Cancer Research Foundation; Assistanc productione des thérapies cellulaires (PACT); William-Laurent et de la Fondation pour l'enfance Blanche Hughes.
Reagents | Vendor | Catalogue number | |||||||||||||
Reagents | |||||||||||||||
DNA plasmid expressing GFP (pmaxGFP) | Lonza | VPA-1002 (kit) | |||||||||||||
PBS | Sigma | D8537 | |||||||||||||
CliniMACS PBS-EDTA | Miltenyi Biotec | 70026 | |||||||||||||
HyQ RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30096.01 | |||||||||||||
Phenol Free RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30605.01 | |||||||||||||
Hyclone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007003HI | |||||||||||||
GlutaMAX (100x) | Gibco | 3505-061 | |||||||||||||
Ficoll-Paque | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-02 | |||||||||||||
Recombinant human IL-21 | PeproTech | AF-200-21 | |||||||||||||
Recombinant human IL-2 (Proleukin) | Novartis | NDC 65483-116-07 | |||||||||||||
Human T cell Kit (Nucleofector Solution) | Lonza | VPA-1002 | |||||||||||||
CliniMACS CD56 Reagent | Miltenyi | 70206 | |||||||||||||
FITC-conjugated to mouse mAb specific for human CD3 | BD Biosciences | 349201 | |||||||||||||
APC-conjugated to mouse mAb specific for human CD4 | BD Biosciences | 340443 | |||||||||||||
PerCPCy5.5-conjugated to mouse mAb specific for human CD8 | BD Biosciences | 341051 | |||||||||||||
PE-conjugated to F(ab’)2 fragment of goat antibody specific for human Fcγ | Invitrogen | H10104 | |||||||||||||
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |||||||||||||
Disposables | |||||||||||||||
12-well plate | Corning | 3513 | |||||||||||||
T-75 cm2 flask | Corning | 430641 | |||||||||||||
Culture bags | Vue Life | 290C; 750C | |||||||||||||
50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||
Amaxa Nuceleofector II | Lonza | AAB-1001 | |||||||||||||
Cellometer | Nexcelom Bioscience | Cellometer Vision | |||||||||||||
Sorvall Legend RT Centrifuge | Sorvall | 75004377 | |||||||||||||
BD FACS Calibur | BD Biosciences | 342975 | |||||||||||||
Controlled rate freezer | Planer | Kryo 750 | |||||||||||||
Irradiator | CIS bio International | IBL-437 C#09433 | |||||||||||||
Complete Culture Media (CCM) (stored at 4 °C for up to 30 days) Flow Cytometry Buffer (stored at 4 °C for up to 30 days) |