टी एक CD19 विशिष्ट chimeric प्रतिजन रिसेप्टर (सीएआर) व्यक्त कोशिकाओं बी सेल malignancies के investigational उपचार के रूप में हमारी पहली में मानव जीन थेरेपी परीक्षण में संचार कर रहे हैं. हम टी कोशिकाओं की आनुवंशिक संशोधन का उपयोग का वर्णन<em> स्लीपिंग ब्यूटी</em> (एसबी) प्रणाली डिजाइनर CD19 + कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं पेश CD19 विशेष कार और चयनात्मक प्रचार शुरू.
The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-γ receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of γ-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.
जीन थेरेपी के लिए Transposon और piggyBac 12,19 और एस.बी. 18,20-22 से जैसे Transposase प्रणाली, गैर वायरल दृष्टिकोण है कि नैदानिक ग्रेड कार के पारगमन वायरल मध्यस्थता + टी कोशिकाओं को एक वैकल्पिक रहे हैं. एस.बी. जीन स्थानांतरण मानव जीन 1,6,23 चिकित्सा के लिए अपनी क्षमता पर आधारित प्रणाली के रूप में चुना गया था. हम एस.बी. (एक कार पेश करने के लिए) स्थानांतरण और γ विकिरणित aAPC के पुनरावर्ती (आनुवंशिक रूप से संशोधित टी कोशिकाओं को प्राप्त stably एक कार व्यक्त) के अनुपालन में TAA विशेष टी कोशिकाओं के निर्माण में प्रौद्योगिकी मंच के रूप में सेवा की दोहरी प्रौद्योगिकी विकसित चरण मैं / द्वितीय परीक्षणों के लिए cGMP (चित्रा 4) के साथ. सह संस्कृति के 28 (चार 7 दिन उत्तेजना चक्र) γ विकिरणित aAPC दिनों के बाद, हम आम तौर पर कम से कम 10 10 आनुवंशिक रूप से संशोधित टी कोशिकाओं मानव अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त उत्पन्न करने में सक्षम हैं. के रूप में की जरूरत है, अतिरिक्त उत्तेजना चक्र किया जा सकता हैओ आनुवंशिक रूप से संशोधित टी कोशिकाओं की बड़ी संख्या उत्पन्न करते हैं. इसके अलावा, अगर कम + कार टी कोशिकाओं की जरूरत है, electroporation और प्रसार करने के लिए दृष्टिकोण बढ़ाया जा वापस कम cuvettes रोजगार और आगे प्रत्येक की शुरुआत में सिर्फ संख्यानुसार aAPC पर प्रसार के बाद के दौर के लिए का विस्तार टी कोशिकाओं की एक उप सेट ले जाने के कर सकते हैं उत्तेजना चक्र. के बहुमत electroporated और टी कोशिकाओं stably कार व्यक्त जलसेक के लिए काटा प्रचारित. CD4 के परिणाम + और CD8 + टी हमारे 2 एन डी पीढ़ी कार व्यक्त कोशिकाओं एक phenotype / स्मृति अनुभवहीन के साथ कोशिकाओं में शामिल हैं और प्रदर्शन पुनः निर्देशित विशिष्टता की तीन पहचान. सबसे पहले, आनुवंशिक रूप से संशोधित टी कोशिकाओं को विशेष रूप से CD19 + लक्ष्य lyse, दूसरी बात, CD19 + उत्तेजक औधधि कोशिकाओं के जवाब में IFN-γ उत्पादन और तीसरे, CD19 के लिए प्रतिक्रिया में पैदा + फीडर कोशिकाओं, एक कार निर्भर 13,18 तरीके में. हमारे integr के लिए दृष्टिकोणविद्युत एस.बी. प्रणाली से गैर वायरल डीएनए plasmids के हस्तांतरण से एक कार transgene खाया मौन प्राथमिक टी पंजाब और यूसीबी से ली गई कोशिकाओं में किया जा सकता है. हम और दूसरों आनुवंशिक K562 कोशिकाओं को संशोधित किया है सेवा के रूप में aAPC कुशलतापूर्वक जलसेक 24,25 के लिए टी कोशिकाओं की चिकित्सकीय पर्याप्त संख्या का प्रचार. aAPC और टिशू कल्चर वातावरण (आईएल-21 के अलावा जैसे) किया गया है उत्पन्न करने के लिए किया गया है संशोधित रोगी और CD19 विशिष्ट जलसेक के लिए hematopoietic स्टेम सेल प्रत्यारोपण के बाद टी कोशिकाओं (1 टेबल) 13,18 दाता व्युत्पन्न. हम कार का उत्पादन PB से टी कोशिकाओं + बस venipuncture द्वारा प्राप्त कर सकते हैं जो लागत, बेचैनी, और PB से apheresis द्वारा बहुराष्ट्रीय कंपनी प्राप्त करने की असुविधा से बचा जाता है. कार की एक बड़ी संख्या + बहुराष्ट्रीय कंपनी की छोटी संख्या से टी कोशिकाओं प्राप्त करने की क्षमता विशेष रूप से प्रत्यारोपण allogeneic यूसीबी के बाद टी कोशिकाओं infusing के लिए अपील कर रही है. छोटे आकार और नवजात दाता के नाम न छापने फिर precludesएक बाद में समय बिंदु तक पहुंचने में इस व्यक्ति और harvested बहुराष्ट्रीय कंपनी के केवल सीमित संख्या टी सेल के निर्माण के लिए सामग्री शुरू hematopoiesis साथ हस्तक्षेप से बचने के रूप में उपलब्ध हैं. विनिर्माण प्रक्रिया के लिए इसके अलावा अग्रिम वर्तमान में कर रहे हैं एक उच्च throughput electroporation से निपटने के लिए कम से कम एक पूरी तरह से बंद लहर bioreactor साथ मिलकर डिवाइस शामिल करने के लिए चल रहा है. कुल मिलाकर, एस.बी. और aAPC प्लेटफार्मों CD19 विशिष्ट कार + टी कोशिकाओं है कि आनुवंशिक रूप से संशोधित टी कोशिकाओं है कि cGMP साथ अनुपालन में वैकल्पिक सेल सतह TAAs पहचान कर सकते हैं की बड़ी संख्या उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है उत्पन्न करने के लिए अपील कर रहे हैं.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Dr. Carl June (University of Pennsylvania) for help generating and providing aAPC clone #4 and Dr. Perry Hackett (University of Minnesota) for help with the SB system.
Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); SPORE (CA136411); Albert J Ward Foundation; Burroughs Wellcome Fund; Gillson Longenbaugh Foundation; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Department of Defense; Estate of Noelan L. Bibler; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; Production Assistance for Cellular Therapies (PACT); William Lawrence and Blanche Hughes Children’s Foundation.
Reagents | Vendor | Catalogue number | |||||||||||||
Reagents | |||||||||||||||
DNA plasmid expressing GFP (pmaxGFP) | Lonza | VPA-1002 (kit) | |||||||||||||
PBS | Sigma | D8537 | |||||||||||||
CliniMACS PBS-EDTA | Miltenyi Biotec | 70026 | |||||||||||||
HyQ RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30096.01 | |||||||||||||
Phenol Free RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30605.01 | |||||||||||||
Hyclone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007003HI | |||||||||||||
GlutaMAX (100x) | Gibco | 3505-061 | |||||||||||||
Ficoll-Paque | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-02 | |||||||||||||
Recombinant human IL-21 | PeproTech | AF-200-21 | |||||||||||||
Recombinant human IL-2 (Proleukin) | Novartis | NDC 65483-116-07 | |||||||||||||
Human T cell Kit (Nucleofector Solution) | Lonza | VPA-1002 | |||||||||||||
CliniMACS CD56 Reagent | Miltenyi | 70206 | |||||||||||||
FITC-conjugated to mouse mAb specific for human CD3 | BD Biosciences | 349201 | |||||||||||||
APC-conjugated to mouse mAb specific for human CD4 | BD Biosciences | 340443 | |||||||||||||
PerCPCy5.5-conjugated to mouse mAb specific for human CD8 | BD Biosciences | 341051 | |||||||||||||
PE-conjugated to F(ab’)2 fragment of goat antibody specific for human Fcγ | Invitrogen | H10104 | |||||||||||||
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |||||||||||||
Disposables | |||||||||||||||
12-well plate | Corning | 3513 | |||||||||||||
T-75 cm2 flask | Corning | 430641 | |||||||||||||
Culture bags | Vue Life | 290C; 750C | |||||||||||||
50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||
Amaxa Nuceleofector II | Lonza | AAB-1001 | |||||||||||||
Cellometer | Nexcelom Bioscience | Cellometer Vision | |||||||||||||
Sorvall Legend RT Centrifuge | Sorvall | 75004377 | |||||||||||||
BD FACS Calibur | BD Biosciences | 342975 | |||||||||||||
Controlled rate freezer | Planer | Kryo 750 | |||||||||||||
Irradiator | CIS bio International | IBL-437 C#09433 | |||||||||||||
Complete Culture Media (CCM) (stored at 4 °C for up to 30 days) Flow Cytometry Buffer (stored at 4 °C for up to 30 days) |