Staphylococcus aureus Vækst med humant hæmoglobin som en jernkilde

Summary

Her beskriver vi en vækst assay for

Abstract

S. aureus er en patogen bakterie, der kræver jern for at udføre vitale metaboliske funktioner og forårsage sygdom. Den mest rigelige reservoir af jern inden i den humane vært, er hæm, som er cofaktoren for hæmoglobin. At erhverve jern fra hæmoglobin, S. aureus anvender et omfattende system kendt som jernreguleret overflade determinant (ISD) system ^1. Komponenter i Isd system først binder vært hæmoglobin, derefter udtrække og importere hæm, og endelig frigøre jern fra hæm i den bakterielle cytoplasma ^2,3. Denne vej er blevet dissekeret gennem talrige in vitro-studier ^4-9. Endvidere har bidrag Isd system til infektion gentagne gange blevet påvist i musemodeller ^8,10-14. Etablering af bidrag Isd system til hæmoglobin-afledt jern erhvervelse og vækst har vist sig at være mere udfordrende. Vækstassays med hæmoglobin som eneste jernkilde er komplicerede by ustabiliteten af ​​kommercielt tilgængelige hæmoglobin, kontaminerende frit jern i vækstmediet, og toksiciteten forbundet med jernchelatorer. Her præsenterer vi en metode, der overvinder disse begrænsninger. Højkvalitets hæmoglobin fremstilles ud fra frisk blod og lagres i flydende nitrogen. Renset hæmoglobin er suppleret ind i jern-nedbryder medium efterligne jern-fattige miljø stødt af patogener inde i hvirveldyr vært. Ved at udsulte S. aureus af frit jern og udvides med et minimalt manipuleret form for hæmoglobin vi inducere vækst på en måde, der er helt afhængig af evnen til at binde hæmoglobin, ekstrakt hæm, passerer hæm gennem den bakterielle cellekappe og nedbrydes hem i cytoplasmaet. Denne analyse vil være nyttig for forskere, der søger at belyse mekanismerne i hemoglobin-/heme-derived jern opkøb i S. aureus og muligvis andre bakterielle patogener.

Protocol

1. Oprensning af hæmoglobin fra frisk blod

1. Erhverve frisk humant blod tilsat en antikoagulant. Holde blodet på is eller ved 4 ° C under hele oprensningen.
2. Centrifugeres blodet i 20 min ved 1.500 x g.. De røde blodlegemer (RBC) vil være i bunden af ​​røret. Forsigtigt sug supernatanten og forsigtigt pellet resuspenderes i iskold 0,9% (vægt / volumen) NaCI-opløsning. Der centrifugeres og vaskes 3 gange.
3. Pellet resuspenderes i 1 volumen iskold 10 mM Tris-HCI (pH 8,0). Dette vil inducere lysis af de røde blodlegemer på grund af osmotisk tryk. Læg toluen til ~ 20% slutvolumen.
4. Inkuber ved 4 ° C på en roterende natten over.
5. Centrifuger lysatet ved 20.000 x g i 1 time. Saml den midterste hæmolysat fraktion forlader toluen (flydende på toppen) og pellet uberørt. Brug en lang hals pipette til at indsamle den midterste fraktion.
6. Passere gennem 0,44 um sprøjte filter. Hvis opløsningen indeholder partiklerstof og ikke kan føres gennem filteret, gentages trin 1.5.
7. Der renses hæmoglobin (Hb) med en højtydende væskekromatografi (HPLC) anionbyttersøjle (Varian, PL-SAX 1000 A 8 um, 150 mm x 4,6 mm). Den mobile fase A er 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) og mobil fase B er 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. En 0% -100% gradient af opløsningsmiddel B køres løbet af 2 minutter ved 2,0 ml / min strømningshastighed. Elueringen overvåges baseret på absorption (λ: 410 nm og 280 nm). Saml kun den brøkdel kendetegnet ved en klar rød farve og en fremtrædende absorptionstop (Figur 1).
8. Dialysere eluering mod phosphatpufret saltvand (PBS) natten over og derefter i et par timer igen. Steriliseres ved passage gennem et 0,22 um sprøjtefilter.
9. For at måle Hb koncentration, forberede standard Hb med kendte koncentrationer i PBS. Bestem koncentrationen af ​​Hb i prøven ved at blande de standardopløsninger (se tabellen med reagenser osed) eller prøveopløsningen med 2x Drabkin reagens (fremstillet ud fra pulver) i forholdet 1:1. For eksempel blande 100 pi Hb-opløsning med 100 pi 2 x Drabkin reagens i plader med 96 brønde. Inkuber i 15 minutter og mål absorbansen ved 540 nm. Plotte en standardkurve og bestemme Hb koncentrationen i prøven. Fem til femten mg / ml udbytter er typiske.
10. Kør 15 til 20 ug oprenset hæmoglobin på en 15% SDS-PAGE in duplo. Stain en af gelerne, overføre proteinerne fra en anden gel på en nitrocellulosemembran og immunoblot for hæmoglobin (fig. 2).
11. Nedfrysning og opbevaring 1 ml prøver af hæmoglobin i flydende nitrogen.

2. Fremstilling af jern-nedbryder vækstmedier

1. Forbered Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium ved at opløse RPMI pulveret i vand, tilsættes natriumhydrogencarbonat som anbefalet af fabrikanten og 1% cassamino syrer (CA) (vægt / volumen). Steriliseres ved passage gennem et 0,2 um filter og opbevar refrigaccelereret.
2. Fremstille metal-depleteret RPMI (NRPMI) ved tilsætning af 7% (w / v) Chelex 100 og blandes natten over på en omrøringsplade. Fjern Chelex 100 ved passage gennem et 0,2 um filter og opbevares nedkølet. Suppler medier med væsentlige ikke-jernholdige metaller: 25 uM ZnCl _2, 25 pM MnCl _2, 100 mM CaCl ₂ og 1 mM MgCl ₂ fremstillet i forvejen som en steril 1.000 x løsning. Brug engangs plastbeholdere til dette trin for at undgå jern forurening fra genanvendelige forsyninger.

3. Staphylococcus aureus Vækst ved hjælp Hæmoglobin som eneste jernkilde

1. Streak S. aureus til isolering på tryptisk soja-agar (TSA) fra en frossen bestand. Inkuber ved 37 ° C i 20-24 timer.
2. Resuspender ethylendiamin-N, N'-bis (2-hydroxyphenyleddikesyre) (EDDHA) i vandfri ethanol til 100 mM. EDDHA går ikke i opløsning, men steriliseres ved ethanol.
3. Læg EDDHA til RPMI til en slutkoncentration på 0,5 mM. TilladEDDHA at opløse i mindst 30 minutter før man går videre til det næste trin. På grund af batch-til-batch-variation kan endelig EDDHA koncentration skal sænkes til 0,25 mM for at muliggøre bakteriel vækst.
4. Inokulere enkelte kolonier af S. aureus i 5 ml RPMI indeholdende EDDHA i 15 ml skruelåg koniske rør. Inkuber ved 37 ° C med rystning ved 180 omdrejninger i minuttet (rpm) i 16-20 timer.
5. Centrifuger overnatskulturer i 5 minutter ved 7500 x g, og pellet resuspenderes i NRPMI indeholdende 0,5 mM EDDHA. Normalisere _OD600 på ~ 3.
6. Forbered NRPMI indeholdende 2,5 ug per ml Hb og 0,1-1,0 mM EDDHA. På grund af variation mellem partier, kan det EDDHA koncentration, der kræves for at chelatere frit jern i NRPMI variere.
7. Subkultur 10 pi bakteriesuspension fra trin 3,5 i 1 ml NRPMI + EDDHA + Hb i et 15 ml skruelåg konisk rør.
8. Inkuberes kulturerne ved 37 ° C i op til 48 timer under omrystning ved 180 rpm eller på en rullende tromle.
600 aflæsninger ved at fjerne 50 ul af kulturen og blande det med 150 pi PBS i 96-brønds plader.

Representative Results

Vi har renset humant hæmoglobin fra hæmolysat med HPLC (protokol trin 1.7). Figur 1 viser optagede absorbansen af eluatet ved 280 og 410 nm bølgelængder. Fraktion 5 blev opsamlet og andre fraktioner blev bortkastet. Udbytter af 5-15 mg hæmoglobin pr milliliter af eluatet typisk opnået. Oprenset hæmoglobin blev analyseret ved SDS-PAGE in duplo, og gelerne blev enten farvet for proteiner eller overført til nitrocellulose og immunblottet (protokol trin 1,10, figur 2).

Vi har vurderet evnen af oprenset humant hæmoglobin til at understøtte væksten af vildtype S. aureus og S. aureus, der mangler ISDB komponent i Isd systemet (Δ ISDB). ISDB er en hæmoglobin-receptor, der kræves for hæmoglobin-afledt jern købet ^12. Vildtype og Δ ISDB blev dyrket i jern-depleteret medium suppleret med human hemog lobin (NRPMI + EDDHA + Hb) som beskrevet i afsnit 3 i protokollen. Når den dyrkes i NRPMI + EDDHA + Hb, vildtype, men ikke Δ ISDB er i stand til at proliferere som indikeret ved en forøgelse i optisk densitet af kulturer over tid (figur 3A). I modsætning hertil er den evne til at udnytte suppleret frit jern (+ _FeCl3) identisk med vildtype og Δ ISDB (figur 3B). Hverken vildtype eller Δ ISDB proliferere i fravær af en jernkilde (figur 3B).

Vi har sammenlignet væksten af S. aureus i NRPMI + EDDHA suppleret med hæmoglobin oprenset fra frisk blod eller lyofiliseret hæmoglobin. Figur 4 viser, at mens hæmoglobin oprenset fra blodet kræver ISDB for vækst, lyofiliseret hæmoglobin muliggør proliferation af Δ ISDB.

s/ftp_upload/50072/50072fig1.jpg "/>
Figur 1. Absorption af elueringsfraktionerne under hæmoglobin oprensning. Absorption ved 410 nm (specifikt for hæm-bindende proteiner) og 280 nm (karakteristisk for alle proteiner) blev overvåget under hele elueringen. Fraktion nummer fem indeholdt hæmoglobin og blev opsamlet.

Figur 2. Oprenset humant hæmoglobin Tyve mikrogram oprenset hæmoglobin blev separeret ved hjælp af denaturerende 15% SDS-PAGE. A. gelen farvet for proteiner med Bio-Rad protein assay dye reagens. B. En nitrocellulosemembran immunoblottet for hæmoglobin. Den intense nederste bånd er en hæmoglobin monomer, mens de mere svage øvre bånd er hæmoglobin dimerer og tertramers, som ikke får fuldstændig denatureret.

/ Ftp_upload/50072/50072fig3.jpg "/>
Figur 3. Anvendelse af humant hæmoglobin som en jernkilde af S. aureus A. Vækst af vildtype (wt) eller isogene hæmoglobin receptor ISDB mutant (Δ ISDB) i NRPMI suppleret med jern-chelator EDDHA og humant hæmoglobin er statistisk forskellige som bestemt ved Students two-tailed t test, p <0,05. B. Vækst i NRPMI suppleret med 10 pM jernchlorid (+ _FeCl3) eller EDDHA _(-FeCl3) er ikke forskellig mellem vægt og Δ ISDB. Grafer afbilder data fra et repræsentativt forsøg, der omfattede tre biologiske replikater. Fejlbjælker angiver standardafvigelsen for optiske densitetsaflæsninger ved angivne tidspunkter mellem replikater.

Figur 4. Vækst af vildtype (wt) eller isogene hæmoglobin receptor mutant (Δ ISDB) i medium suppleret med hæmoglobin oprenset fra frisk blod eller lyofiliseret hæmoglobin. Grafen viser data fra et repræsentativt forsøg, som omfattede tre biologiske replikater. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen af ​​optiske densitetsaflæsninger ved angivne tidspunkter mellem replikater. Asterisker angiver værdier, som er statistisk forskellige som bestemt ved Students two-tailed t test, p <0,05.

Discussion

Jern er et vigtigt næringsstof kræves af organismer fra alle riger af livet ^15. I hvirveldyr, er jern sekvestreret at undgå toksicitet forårsaget af dette element. Denne beslaglæggelse også skjuler jern fra invaderende mikrober i en proces kendt som ernæringsmæssig immunitet ^16. Som reaktion herpå har patogener udviklet strategier, der omgår ernæringsmæssig immunitet. Én sådan mekanisme er baseret på hæmoglobin, der er den mest rigeligt forekommende kilde til jern i værten ^17. Hæmoglobin indeholdt i de røde blodlegemer. Hæmoglobin frigjort fra beskadigede røde blodlegemer er bundet af værten haptoglobin, som signalerer hurtig fjernelse af haptoglobin-hæmoglobin-komplekser af makrofager ^18. For at få adgang til hæmoglobin, S. aureus udtrykker hæmolysiner, som lyserer røde blodlegemer ^19. Haptoglobin-induceret hæmoglobin fjernelse imødegås ved højaffinitetsbinding af hæmoglobin fra de celleoverfladereceptorer udtrykkes af 20.

Talrige undersøgelser har vist bidrag Isd system til infektion ^8,10-14. Endvidere har biokemiske undersøgelser tildelt funktionerne af de enkelte komponenter i hæmoglobin-afledt jern erhvervelse ^4-9. Her beskriver vi et assay, der overvåger væksten af S. aureus med hæmoglobin som den eneste kilde til tilgængelig jern. I den forbindelse er vi nødt til at påpege visse betingelser, der er afgørende for en vellykket gennemførelse af forsøget.

Kvaliteten og typen af ​​reagenser anvendt i hæmoglobin-afledte jern erhvervelse vækstassays kan dramatisk påvirke resultaterne obtaineret i disse assays. I modsætning til hæmoglobin opnået fra frisk blod, hæmoglobin, der er lagret i lyofiliseret form giver bakterievækst uafhængigt af komponenterne i Isd systemet (figur 4) ^21. Dette skyldes sandsynligvis ændringer i strukturen af ​​hæmoglobin, der er induceret af lyophylization. Specifikt lyofiliseret hæmoglobin indeholder tetramerer, dimerer og monomerer af hæmoglobin, samt hæm i sin frie form ^22. Oprensning af hæmoglobin fra frisk blod og dets opbevaring i flydende nitrogen sikre integriteten af proteinet ^22. Omfattende forskning på hæmoglobin har lettet udviklingen af protokoller for oprensning af høj kvalitet hæmoglobin fra frisk blod eller i rekombinant form, som kan anvendes i vores assay ^23-25.

Valget af jernchelator kan påvirke væksten assay. For eksempel er 2,2-dipyridyl, som ofte anvendes som en jern-chelator, giftigttil bakterieceller ^26. Disse to virkninger gør det svært at skelne, om inhibering af bakterievækst ved 2,2-dipyridyl skyldes jernkelations eller toksicitet. Desuden 2,2-dipyridyl sandsynligvis er membran permeabel, og således trænger ind i bakteriecellen og chelater jern intracellulært ^27. Det har vist sig, at vækstinhibering af EDDHA reverseres ved tilskud af en jernkilde, hvilket gør EDDHA et mere velegnet jernchelator for bakterielle vækstassays. Imidlertid kan koncentrationen af ​​EDDHA, der skal sættes til vækstmediet kan variere. Dette skyldes variation af både EDDHA styrke og vækstmedium jernindhold fra batch til batch. Den jernchelaterende aktivitet kan normaliseres mellem partier af EDDHA ved kemisk fjernelse af resterende jern ^28. På grund af variation mellem partier af RPMI, fandt vi, at den endelige EDDHA koncentrationen stadig kan være nødvendigt at justere at tillade vækst i nærvær af en jernkilde. Vi fandt thved den højeste koncentration af EDDHA, der er permissiv for vækst af vildtype S. aureus i nærvær af hæmoglobin er optimal for dette eksperiment.

Ændringer kan foretages til den nuværende protokol til mere ligner miljøet stødt af bakterier under infektion. For eksempel, i værten er hæm, der er frigivet fra hæmoglobin hurtigt bundet af hæmopexin. Hæmopexin kan ikke bruges som en jernkilde af S. aureus, derfor tilsætning ville forhindre erhvervelse af hæm frigivet fra hæmoglobin under inkubation med S. aureus ^12.

Vi mener, at dette assay kan anvendes til forskning i metal erhvervelse af en række bakterielle patogener. Desuden kan denne fremgangsmåde anvendes til at måle jern erhvervelse fra ikke-hæmoglobin kilder til jern, der er til stede i værten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC anion exchange column	Varian	PL1551-3802
Drabkin's reagent	Sigma	D5941-6VL
Hemoglobin standard	Pointe Scientific	H7506-STD
RPMI	HyClone	SH30011.02
Chelex 100 sodium form	Sigma	C7901
EDDHA	LGC Standards GmbH	ANC 001
Hemoglobin a antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc	SC-21005
Tryptic soy agar	BD	236920