Screening for Melanom Modifiers ved hjelp av en Sebrafisk stedegen Tumor Model
Summary
En rask måte å screene for melanom modifikatorer ved hjelp av en sebrafisk stedegen tumormodell presenteres. Det tar nytte av miniCoopR vektor som tillater uttrykk av kandidat melanom gener i melanocytter. En metode for å få melanoma overlevelse kurver, en invasjon analysen, en protokoll for antistoffarging av skalaen melanocyttene og en melanom transplantasjon analysen er beskrevet.
Abstract
Genomisk studier av kreft hos mennesker har gitt et vell av informasjon om gener som er endret i svulster 1,2,3. En utfordring som oppstår fra disse studiene er at mange gener er endret, og det kan være vanskelig å skille genetiske forandringer som kjørte tumorigenesis fra at de oppsto øvrig under transformasjon. Å trekke dette skillet er det gunstig å ha en metode som kan kvantitativt måle effekten av en endret genet på startfasen og andre prosesser som gjør at svulster å vedvare og spre. Her presenterer vi en rask måte å skjerme stort antall kandidat melanom modifikatorer i sebrafisk ved hjelp av en stedegen tumormodell 4 som omfatter tiltak som kreves for melanom initiering og vedlikehold. Et sentralt reagens i denne analysen er miniCoopR vektor, som par et villtype kopi av mitfa melanocyte spesifikasjonen faktor til en Gateway rekombinasjon kassett inn hvilken kandidat melAnoma genene kan rekombineres 5. Den miniCoopR vektor har en mitfa reddende minigene som inneholder promoteren, åpne leseramme og 3'-ikke-translaterte regionen av villtype mitfa genet. Det tillater oss å gjøre konstruerer med full-lengde åpne leserammer av kandidat melanom modifikatorer. Disse individuelle kloner kan deretter injiseres inn i én celle Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (LF), mitfa (LF) sebrafisk embryoer. Den miniCoopR vektor blir integrert av Tol2-mediert transgenesis 6 og redder melanocytter. Fordi de er fysisk koblet til mitfa reddende minigene er kandidat gener uttrykt i reddet melanocytter, noen som vil forvandle og utvikle seg til svulster. Effekten av en kandidat genet på melanom initiering og melanom celle egenskaper kan måles ved hjelp av melanom-free overlevelseskurver, invasjon analyser, antistoffarging og transplantasjon analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den miniCoopR metoden muliggjør uttrykket av gener av interesse i sebrafisk melanocytter. Denne tilnærmingen tar fordel av det faktum at sebrafisk mitfa genet virker celle-autonomt. Av denne grunn, melanocytter reddet av miniCoopR vektoren er sikker på å inneholde minigene og eventuelle gen av interesse som det er fysisk koplet. Reddet melanocyttene er godt synlig og kan fås hos dyr som ble injisert som encellede embryoer. En spesifisert grad av chimerism er valgt, og dyr som overgår denne cutoff kan scor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Leonard I. Zon i hvis laboratoriet disse teknikkene ble opprinnelig utviklet; Kristen Kwan og sent Chi-Bin Chien for gaver plasmider som brukes i dette arbeidet, James Lister og David Raible for å få hjelp med antistoffarging og James Neiswender for den mikroinjeksjon video. Dette arbeidet ble finansiert av NIH stipend R00AR056899-03 til CJC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
References
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Curtin, J. A., et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).
- Lin, W. M., et al. Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma. Cancer Res. 68, 664-673 (2008).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).
- Ceol, C. J., et al. The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset. Nature. 471, 513-517 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
