对黑色素瘤修饰符一个斑马鱼原地肿瘤模型的筛选
Summary
屏幕使用一个斑马鱼原地肿瘤模型的黑色素瘤的改性剂是一种快速的方式。它利用的miniCoopR允许候选黑色素的黑素细胞中的基因表达的载体。黑色素瘤生存率曲线，入侵检测，协议规模的黑素细胞抗体染色和黑色素瘤移植试验的方法获得。
Abstract
的人类癌症基因组学研究已经取得了丰富的信息改变的基因，在肿瘤1,2,3。从这些研究中所产生的一个挑战是，许多基因被改变，它可以开车从那些在转换过程中偶然产生的肿瘤的遗传改变，很难区分。作出这样的区分是有好处的分析，可以定量衡量一个改变基因在肿瘤的发生和流程，使肿瘤的坚持和传播的效果。在这里，我们提出了一个快速的方法来筛选大量的候选黑色素瘤修饰符在斑马鱼黑色素瘤的启动和维护所需的步骤，包括一个土生土长的肿瘤模型4。在此分析是一个关键试剂的miniCoopR载体，这对新人的mitfa黑素细胞的规范因素的野生型拷贝到网关重组盒候选人梅尔阿诺马基因可重组5。 miniCoopR矢量具有mitfa的的抢救小基因的其中包含的的野生型mitfa的基因的启动子，开放阅读框和3'-非翻译区的。它使我们能够使用全长度的开放阅读框的候选人黑色素瘤修饰符的结构。个人可以被注入单细胞TG（mitfa：BRAF V600E）p53蛋白（LF）; mitfa（LF）斑马鱼胚胎克隆。矢量被集成miniCoopR TOL2介导的转基因6和救援黑色素细胞。因为它们被物理地连接至的mitfa挽救小基因，候选基因的表达在获救的黑素细胞，其中的一些将改造，并发展成肿瘤。对黑色素瘤的启动和黑色素瘤细胞属性的候选基因的效果，可以使用无黑色素瘤生存曲线，入侵检测，抗体染色和移植试验测定。
Protocol
Representative Results
Discussion
miniCoopR方法使表达的基因在斑马鱼的黑素细胞的兴趣。这种方法利用的事实，的斑马鱼mitfa基因的作用细胞自主性。出于这个原因，黑素细胞获救由miniCoopR载体是一定要包含小基因和任何感兴趣的基因，它在物理上耦合。营救黑素细胞是清晰可见，能够得到在被注射的动物，作为单细胞胚胎。特定程度的嵌合体被选中，并可以拿下超过此截止动物肿瘤发病或其他特性。的一大好处是足够的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢伦纳德一博士在他的实验室，这些技术最初开发区域生态克里斯汀关和已故的简智彬在这项工作中所用的质粒的礼物，詹姆斯·李斯特和大卫Raible抗体染色的援助;和詹姆斯Neiswender显微注射的视频。这项工作是由美国国立卫生研究院授予R00AR056899-03 CJC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
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