T6SS로 인한 세균 경쟁을 모니터링 할 비주얼 분석

Summary

우리는에 의해 중재 세균 경쟁 업체를 모니터 할 수있는 질적 분석을 설명<em> 녹농균</em> 유형 VI의 분비 시스템 (T6SS). 검정은을 가진 대장균 대상 세포의 생존 / 살인에 의존<em> lacZ</em> – 기자. 이 기술은 T6SS – 숙련 된 미생물의 bactericidal / bacteriostasis 활동을 평가하는 조절합니다.

Abstract

유형 VI의 분비 시스템 (T6SSs)는 그람 음성 박테리아 타겟 세포의 ^1,2 다양한으로 단백질을 운반하고 주입 할 수 있도록 분자 nanomachines 있습니다. T6SS은 13 핵심 구성 요소로 구성하고 bacteriophages ^3의 꼬리 – 관과 구조 유사성을 표시합니다. 파지는 튜브 및 대상 세균의 세포 봉투에 침투 DNA를 삽입 할 수있는 펑 쳐링 장치를 사용합니다. 그것은 T6SS는 표면에 effectors과 독소를 운전 세균 세포 봉투에서 특정 경로를 만드는 역 박테리오파지 장치입니다 제안합니다. 과정은 더 촬영 할 수 있으며 T6SS 장치는 따라서 이러한 목표에 effectors를 주입, 박테리아가 접촉하는 다른 세포를 구멍 수 있습니다. 꼬리 관과 T6SS의 펑 쳐링 장치 부품은 각각 ^4,5, HCP와 VgrG 단백질로 만들어집니다.

T6SS의 기능성이 제품을 통해 입증되었습니다다양한 세균 병원균을 사용하여 tudies. 비브리오 cholerae의 T6SS는 C-터미널 고를 가교 도메인 ^6,7를 갖고 "발전"VgrG을 주입하여 진핵 숙주 세포의 세포 골격을 개조 할 수 있습니다. 또 다른 인상적인 예를 들어 최근 따라서 특정 미생물 틈새 시장 및 경쟁 환경 ^8,9,10에서 박테리아의 설립을 촉진, T6SS에 의존 방식으로 박테리아를 타겟으로하고 죽일 수 있습니다 녹농균을 사용하여 문서화되었습니다.

후자의 경우, 즉 세 T6SS – 분비 단백질, Tse1, Tse2 및 Tse3이 대상 세균 (그림 1)에 주입 독소로 확인되었습니다. 기증자 세포는 Tsi1, Tsi2 및 Tsi3 면역 단백질 ^8,9,10에 의해 중재 해독제 메커니즘을 통해 이러한 effectors의 해로운 영향으로부터 보호됩니다. T6SS – 실력 박테리아가 S에 공동으로 재배하는 경우이 항균 활성을 모니터링 할 수 있습니다다른 박테리아 종으로 또는 같은 종 ^{8,11,12,13의} T6SS – 비활성 박테리아와 경쟁에서 olid 표면.

사용할 수있는 데이터는 항생제 제조사에 크게 의존 시간이 소요 CFU 계산을 포함하여 세균 경쟁 분석에 숫자 접근 방식을 강조했다. P. 같은 항생제 내성 변종의 경우 aeruginosa,이 방법이 부적절 할 수 있습니다. 또한, 100 개 이상의 박테리아 genomes ¹⁴ 200 다른 T6SS loci의 식별과 편리한 검사 도구는 매우 바람직하다. 우리는 사용하기 쉬우 및 표준 실험실 자료와 시약을 필요로하는 검정을 개발했습니다. 방법은 lacZ 유전자의-complementation을 허용하는 먹이 (이 경우에는 대장균이 DH5α)로 기자 스트레인을 사용하여 T6SS에 의존 bactericidal / bacteriostasis 활동을 모니터링 할 수있는 신속하고 질적 기술을 제공합니다. 전반적으로,이 방법은 grap입니다혼성 집적 회로 및 한천 플레이트에 T6SS 관련 phenotypes의 빠른 식별 할 수 있습니다. 이 실험 프로토콜은 계정으로 이러한 성장 미디어, 온도 나 접촉 시간 등 특정 조건을 복용 다른 변종이나 세균 종에 적용 할 수 있습니다.

Protocol

1. 박테리아 변종과 문화 (표준 CaCl 2 치료 electroporation을 사용하여) 15 E.를 변형하여 대장균받는 셀을 (먹이, P) 엔지니어 lacZ 유전자 (표 1)의-complementation을 허용하는 플라스미드와 대장균 DH5α 세포를. 판 Luria-Bertani 한천 플레이트에 변형 세포 (LBA, 1.5 %의 한천)가 포함 된 5 – 브로 모-4 – 클로로 인돌 릴-β-D-galactopyranoside (X-여자) 40 MG / ML 최종 농도 및 적절한 항생제. ° C 하룻밤 다음과 같은 아침 (§ 1.3 참조) 푸른 transformants에 대해 선택한 37 품다. T6SS – 활성 녹농균 기증자 세포 성장 (D +) 또는 T6SS – 비활성 (D-) (표 1) 밤 LBA에 37 번 ° C. 예제에서 우리는 P.를 사용 여기에 제시된 aeruginosa의 retS가 소유 변형constitutively 활성화 H1-T6SS 16 H1-T6SS 유전자 클러스터 (표 1)의 삭제와 isogenic 돌연변이. 다음 날, E. 사이에 밝은 파란색 복제를 inoculating하여 aerated 플라스크에 밤새 액체 문화를 준비 판에서 대장균의 transformants (P)은 적절한 항생제로 보충 tryptic 간장 국물 (TSB)의 5 ML에 § 1.1에 설명되어 있습니다. 37 교반에 따라 성장 ° C. § 1.2에 설명 된 판에서 – (D) (D +) 및의 단일 식민지와 동일하게 진행합니다. 2. 경쟁 분석 다음 날 실험에 대한 LBA 판을 준비합니다. 이 플레이트가 제대로 (분젠 버너 근처 또는 층류 캐비닛에 표시) 건조되어 있는지 확인하십시오. (D -) 긴장 (D +)에 대해 "분석 – 입력"(A-입력) 판을 준비하고, (P </strong>). "검정 출력"(A-출력) 변종에 대한 판을 준비 (D – + P)와 (D + + P). 분할하고 이에 따라 번호판을 레이블을 붙입니다. 하루 아침에 성장 후 (§ 1.3 참조), 입력 세균성 문화 (D – D +와 P)의 광학 밀도 (OD 600nm)를 측정하고 각 변형의 1 단위 OD 600nm에 세포 밀도에 상응를 얻을하는 데 필요한 볼륨을 계산 . 각 "입력"세포 배양 (D – D +와 P) 처음 멸균 1.5 ML Eppendorf 튜브에 수집됩니다. 상온에서 1 분 동안 13,000 rpm으로 세균 샘플을 원심 분리기하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. D의 알약을 Resuspend -, D +, 및 P의 부드러운 pipetting하여 신선한 TSB의 100 μl의 문화, 그리고 각 이리와! 빨리 10 ML의 예방"A-입력"플레이트 (§ 2.1 작성)의 한 곳으로 부담을 sponding. "A-출력"판을 (§ 2.1 작성) 예방. 더 정확하게, 30 μl (P)과의 30 μl로 (D +)의 부드럽게 30 μl를 혼합 (D -) 두 개의 Eppendorf 튜브 (사용 된 문화가 § 2.4에 설명되어있는 것을주의) 30 ML (P)과 . 믹스 (D + / P)의 20 μl의 예방 및 (D – / P)의 "A-출력"판에 개별적 있습니다. 장소 근처에 분젠 버너를 건조하고 박테리아 살해가 진행되는 동안 시간의 적절한 기간 동안 37 ° C에서 보육의 판을 게재 할 수 있습니다. P.의 경우 aeruginosa는 ​​효율적인 세균 살해은 5 시간의 부화 후 T6SS 결함이있는 변형과 활성 T6SS를 비교했을 때 관찰된다. 3. t의 질적 전망대그 세균 살인 40 μg / ML 분석의 판독을위한 X-여자를 포함 LBA 판을 준비합니다. 플레이트는 "판독 입력"또는 격리 된 박테리아 또는 "판독 출력"또는 "R-출력"혼합 박테리아 문화를 파악하고 따라서 죽이는 성능을 읽을를 발견하려면 "R-입력"라고합니다. 이 번호판은 제대로 건조도 필요합니다. 그 뒤에 다른 네 동일한 부분에 금속판을 나눈다 0, 10 -1, 10 -2, 10 -3이 부분을 주석 (§ 3.3 참조) 한천 플레이트에 탐지하는 박테리아 문화의 dilutions을 지정. 희석 같은 곳에서 흰색 / 파란색 박테리아 비율의 반 정량 평가를 할 수 있습니다. "A-입력"플레이트 (§ 2.4 참조)에서 멸균 루프 개인 세균 명소와 "A-출력"플레이트 (§ 2.5 참조) 수집 및 TSB 1 ML을 포함하는 별개의 1.5 ML Eppendorf 튜브의 각 자리를 resuspend. 효율적으로 resuspend 30 분 동안 Eppendorf 흔드는 블록에 배치세균. TSB 900 μl를 포함하는 5 회 3 Eppendorf 튜브 일련의 준비와 10 -3 ~ 10 배 시리얼 dilutions까지 각 resuspended 곳으로 진행합니다. 피펫 팁을 변경하고 각 희석 단계 사이의 소용돌이 5 초에해야합니다. , undiluted 정지에 가장 희석로 시작하여 40 μg / ML X-여자를 포함 잘 말린 LBA 판에 § 3.3에서 조리하여 세균 dilutions의 야생 "A에 대한 다음의"R-​​입력 '판을 만들기 위해 진행 – 입력 "장소와"A-출력 "부분 (그림 2) R-출력"에 대한 판 ". 동질적인 세균 현탁액을 유지 야생로 이동하기 전에 잠시 소용돌이 각 관. 구역 내에 결과, 세중의에 자리 20 μl (그림 2)의 재현성하십시오. 장소는 개별적으로 접시에 분리 된 상태로 유지하고 서로를 향해 활강하지 않아도 돼 이후 판의 상대적 건조는이 단계에서 중요합니다. 경쟁 분석의 정량화는 실험이 단계에서도 가능합니다. 단계 3.3에 이어, 40 μg / ML X-여자를 포함 LBA 플레이트에 희석 10 -3 100 μl을 알리십시오. 결과의 재현성를 들어, 'A-출력 "판의 각 지점에 대한 세중의에 도금을 수행합니다. ° C 배양기 박 (16 시간의 배양에 해당) 37 년에 희석 판을 놓습니다. 푸른 식민지 (살아 남은 P 세포)의 계산을 수행합니다. 경쟁의 5 시간 후 얻은 전형적인 결과는 그림 3에 표시됩니다. 각 지점에서 초과 액체의 흡수를 허용하도록 무균 지대 내의 플레이트 개방 (NO 뚜껑)를 둡니다. 밤에는 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다. 이 부화 시간 동안 살인은 여전히 두 변종 접촉에 아직도 있기 때문에 (D + / P) 혼합에서 발생합니다. 사진을 찍으또는 출력 분석 (그림 2)에 대한 번호판을 검사합니다. 장소는 주로 파란색으로 남아 어디서 나타냅니다 E. 대장균은 P.에 의해 살해되지 않았습니다 aeruginosa. 그게 사건 때 E. 대장균은 T6SS – 결함이있는 P.과 혼합되어 aeruginosa 변형 (D-) (그림 2, 오른쪽 하단에있는 판).

Representative Results

전형적인 결과는 표 1에 설명 된 긴장과 시약과 그림 1에 표시됩니다. 이 그림에 표시된 플레이트는 하루 아침에 부화 한 후 스캔했다. "판독 – 입력"접시는이 분석에서 사용되는 변종에 대한 일련 희석 패턴을 보여줍니다. 예상대로, E. 대장균하는 동안 기증자 P., overexpressing는 lacZ 유전자가 X-여자에 보충 미디어에 파란색 표시 부분 (P)를 먹이로 aeruginosa의 긴장 (D +, T6SS 활성화) 및 (D – T6SS 비활성) 흰색 남아 있습니다. 먹이와 T6SS 활성 스트레인 (D + / P) 사이의 혼합은 푸른 색의 실종을 보여 발견 된있는 "판독 출력"접시 따라서이 살해 당했다는 표시 먹이. 이것은 먹이를 outcompete 할 수있는 기증자의 능력을 보여줍니다. (에 푸른 색의 지속성D – / P) 판은 푸른 먹이를 죽이려는 비활성 T6SS 기증자의 무능력을 보여줍니다. 1 그림. E.의 죽이는 T6SS – 실력 P.에 의해 대장균 aeruginosa. P. aeruginosa는 ​​E.에 독소를 주입 T6SS 종속적 인 방식으로 대장균은 대상 셀 (흰색 화살표로 표시). 두 독소 Tse1 및 Tse3은 (황색 및 적색 원) E.에 주입 아르 대장균의 periplasm과 peptidoglycan 9 저하. Tse2 독소 (노란색 원)가 E.에 주입되는 대장균 세포질 및 정균 활동주세요 8,10 있습니다. 독소의 결합 작업은 대상 세포를 (번개와 두개골의 플래시) 살인. 대상 셀의 생존은 (그림 2 참조) 생산 β-갈 락토의 활동을 모니터링하여 감지 할 수 있습니다. P.는eruginosa은 면역 단백질 Tsi1, Tsi2 및 Tsi3 (각각 오렌지색, 노란색과 붉은 광장) 8,9,10에 의한 독소의 활동에 대해 보호됩니다. 그림 2. 한천 플레이트 분석은 T6SS 종속적 인 박테리아 살인을 모니터링하는 방법이 그림에서 상부 D의 일련 dilutions 구성된 "판독 – 입력 '접시에 표시됩니다 -., D +, 및 P 입력 세포. P 입력 셀은 lacZ 유전자의 α-complementation로 인해 파란색이고 따라서 생산 β-갈 락토 cleaves는 X-여자 것을. 하단 부분에 활성 (D + / P) 사이의 세균 믹스의 일련 dilutions으로 구성된 "판독 출력"번호판을 표시됩니다 </str긴 사연>, 또는 비활성 (D – / P), T6SS 기증자 P. E.로 aeruginosa 스트레인 대장균은 먹이. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 그림 3. E.의 살인 정량화 P.에 의해 대장균 5 시간의 부화 후 aeruginosa이 있습니다. 그래프는 E.의 CFU 계산을 제시 대장균은 3.4 단계에 설명되어 있습니다. 결과는 살해의 대부분은 접촉 5 초기 시간 동안 진행되는 제안, T6SS +와 T6SS – 변종 사이에 3 배 차이를 보여 여기 소개했다.

Discussion

이 문서에서 제시하는 방법은 T6SS로 인한 bactericidal / bacteriostasis 활동의 시각적 관찰 할 수 있습니다. 검정은 한천 플레이트의 표면에 수행됩니다. 그것은 이전에 혼합 박테리아 액체 문화와 수행 T6SS에 의존 살해 분석 때문에 두 박테리아 ^팔 사이에 꾸준한 접촉의 부족의 가능성이 효율적 아니라는 것을 보여왔다. T6SS는 대상 셀 ^17에 DNA를 주입하는 bacteriophages에서 사용하는 것과 유사한 메커니즘으로 작동하도록 생각됩니다. 액체 문화에서 T6SS의 튜브와 같은 구조가 더 쉽게 손상 될 수 있으므로, 간 세균 연락이 손실 될 수 있으며, 독소는 효율적으로 전달되지 않습니다.

부화 시간의 측면에서, 우리는 기증자 변형과 먹이 사이에 설명하는 접촉 5 초기 시간은 P. 사이에 박테리아 살인을 관찰 할 충분 aeruginosa와 E. 그림 3에 도시 대장균, </strong>. 그럼에도 불구하고,이 실험 조건을 최적화하기 위해 운동을 수행하여 부화 시간을 조정하는 것이 좋습니다.

이 방법은 색상 기반 기술이기 때문에, 출력 결과는 기증 스트레인의 착색에 의해 손상 될 수 있습니다. 예를 들어, P.의 경우 aeruginosa, 일부 변종은 먹이의 구별이 상대적으로 어렵게, 검정 판독을 방해 할 수 등 pyocyanin 및 pyoverdine과 같은 색의 안료 높은 수준을 생산하고 있습니다. 예 마젠타 – 여자 또는 붉은 여자와 같은 다른 chromogenic β-갈 락토의 기판은, X-갤런 (표 1) 대신 사용할 수 있습니다.

경쟁 분석은 표시 장치에 대한 다른 기자 유전자를 이용하실 수 있습니다. 예를 들어, 유사한 분석은 또한 녹색 형광 단백질이라는 수수께끼할까요? ^12을 사용하여 수행되었습니다.

우리 분석은 양적되지 않고, 좋은 표시를 제공합니다T6SS 활동은 생존 또는 기자 먹이의 살해를 기반으로하기 때문입니다. 이 기술은 쉽게 모든 세균 종에서 T6SSs의 bactericidal / bacteriostasis 활동을 평가하는 것이 편리라는 장점을 제공합니다. 지금까지 T6SS의 활동은 그람 음성 박테리아와 T6SS에 민감한 그람 양성 세균의 알 수없는 예에 대해 표시되었습니다 아직 ¹² 신고되었습니다. 이 테스트 할 수있는 다른 박테리아 종의 문화에 비 호환성 (예 성장 온도, 산소, 특정 미디어)으로 간주 할 것을 또한 분명합니다.

우리 검정도 분비 독소도 흔적이 먹이를 죽일 수있는 충분한 될 수 있기 때문에 T6SS 구성 요소의 어떤 절대적으로 필수적입니다 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 문화 표면에 뜨는과 서양 얼룩를 사용하여 표준 절차 테스트 T6SS에 따라 달라 분비에 비해 T6SS의 약한 활동은 다음 명확하게 분석에 의해 감지 될 수분석. 그러나, 적절한 집락 형성 단위 (CFU) 계산은 여전히​​이 T6SS 활동의 정확한 정량화가 필요합니다.

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
P. aeruginosa PAKΔretS (D+) (active T6SS)	Lab strain		Described in Reference 16
P. aeruginosa PAKΔretSΔH1-T6SS (D–)(inactive T6SS)	This study		The H1-T6SS cluster (encompassing the genes PA0070 to PA0095) has been deleted by allelic exchange following the procedure described in Reference 18. The mutator fragment was generated with the following set of primers: The Up fragment primers: 5′-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3′, and 5’CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3′. The Down fragment primers : 5′-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3′, 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3'
E.coli DH5α	Invitrogen	18258-012	F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1
pBluescript II SK(+)	Agilent	212205	This vector expresses the α peptide of β-galactosidase used for α-complementation.
X-gal	Invitrogen	15520-018	Use at 40 μg/ml
Luria Bertani agar	Merck-chemicals	1.10283.0500
TSB (casein soya bean broth)	Oxoid	CM109
Vortex shaker Genius 3	IKA	3340000
Scanner	Epson	V700
Spectrophotometer	WPA Biowave	CO8000 Cell Density Meter
Magenta-gal	Bioworld	30350001-1 (715241)
Red-gal	Research organics	1364c
			Table 1. Strain, plasmid, material and reagent used.