Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة فخ الجين إقحامي الطفرات باستخدام GAL4-VP16 كما مراسل الابتدائية وGFP / RFP كما صحفيين الثانوية في الزرد. حوالي واحد من كل عشرة عالية، معربا عن F0 محصول الأسماك الجين فخ ذرية المشترك، معربا عن GFP وطلب تقديم العروض. إجراءات الفحص يمكن زيادتها بسهولة للتكيف مع حجم المختبر أداء الشاشة الطفرات إقحامي.
Abstract
كبير حجم مخلب والتنمية الخارجية الأجنة الزرد شفافة بصريا جعل نظام نموذج الفقاريات استثنائية لفي الجسم الحي باستخدام الطفرات إقحامي للصحفيين الفلورسنت لعلامة التعبير عن الجينات المتحولة. وقد شيدت العديد من المختبرات واختبار ناقلات محسن والجينات فخ في الزرد، وذلك باستخدام البروتينات الفلورية، تفعيل النسخي مقرها LEXA-GAL4 وكما صحفيين 1-7. كان لهذه النواقل اثنين من السلبيات المحتملة: التشدد الأمثل (مثل عدم القدرة على التفريق بين الأحداث محسن والجينات فخ) وطفرات منخفضة (مثل التكامل في الجينات نادرا ما تنتج الأليلات فارغة). وقد وضعت الجينات يكسر ينقول (GBTs) لمعالجة هذه العيوب 8-10. قمنا بتعديل واحدة من ناقلات GBT الأولى، GBT-R15، للاستخدام مع GAL4-VP16 كما مراسل الأولية فخ الجينات وUAS وأضاف: كما EGFP مراسل الثانوية للكشف المباشر للأحداث فخ الجينات. Application من GAL4-VP16 كما مراسل فخ الجين الأساسي يوفر ميزتين الرئيسية. أولا، لأنه يزيد الحساسية للجينات التي أعرب عنها في مستويات التعبير المنخفض. الثاني، فإنه تمكن الباحثون لاستخدام خطوط فخ الجين كسائقين GAL4 إلى التعبير المباشر عن الجينات المحورة أخرى في أنسجة محددة للغاية. وهذا هو ذات الصلة وخاصة بالنسبة للجينات مع وظائف غير الضرورية أو الزائدة عن الحاجة، حيث قد لا يؤدي فخ الجين التكامل في الظواهر العلني. وسيئات استخدام GAL4-VP16 كما مراسل فخ الجين الأساسي هو أن الجينات الترميز للبروتينات مع تسلسل إشارة N-محطة ليست قابلة للمحاصرة، وكذلك الناتجة GAL4-VP16 البروتينات الانصهار غير المرجح أن تكون قادرة على الدخول نواة وتفعيل النسخ. الأهم من ذلك، استخدام GAL4-VP16 لا قبل تحديد البروتينات النووية: نحن تعافى الجينات طفرات في الجينات فخ ترميز البروتينات التي تعمل في النواة، السيتوبلازم والغشاء البلازمي.
Introduction
وقد ثبت الطفرات إقحامي ليكون نهجا قوية لتشريح وظيفة الجين في نظم نموذج مختلف الكائنات وحيدة الخلية مثل من البكتيريا والخميرة لالكائنات متعددة الخلايا مثل الفئران والنباتات. أي DNA الخارجية (فيروس، أو ينقول البلازميد) قد تكون بمثابة المغير عن طريق قطع عناصر أساسية من الجينات مثل الإكسونات أو المروجين. الهدف الفعال لهذه النهج بسيطة صغيرة جدا في الجينوم مجمع كبير، منذ تشكل الإكسونات 1-3٪ فقط من الفقاريات الجينوم نموذجية. فعالة صغيرة الحجم المستهدف يمكن التغلب عليها بنسب التكامل ناقلات عالية جدا، كما يتضح من النجاح الهائل من الطفرات إقحامي فيروسات في الزرد 11،12. في المقابل، تشكل الإنترونات حوالي 20-30٪ من الجينوم الفقارية. في الزرد، القائم على ناقلات ينقول الطفرات إقحامي الذي يعرض بشكل فعال فارغة أو الطفرات hypomorphic شديدة على الاندماج في الإنترونات وتمت تسمية "الجين كسر transposoنانوثانية "(GBTs) 8-10. للكفاءة التكامل فخ الجين، فإنها تستخدم الحد الأدنى من Tol2 ينقول 13،14. مسبب للطفرات الجينية من GBTs تعتمد على المشتقة من الأسماك لصق متقبل والنسخي تسلسل إنهاء / تذييل بعديد الأدينيلات. ويحيط العناصر المسؤولة عن طفرات GBT من مواقع loxP المباشر لاستئصال من قبل لجنة المساواة العرقية recombinase. وهكذا، حقن مرنا لجنة المساواة العرقية يؤدي إلى الارتداد كفاءة الطفرات المستحثة GBT، على الرغم من بعض متواليات ينقول تبقى في موضع التكامل 9،10.
ناقلات GBT نشرت مؤخرا استخدام mRFP كما في فخ الجين مراسل 9،10، مما يؤدي إلى اثنين من أوجه القصور المحتملة. الأولى، فإنه لا يعرف ما جزء من الجينات الزرد يتم التعبير على مستوى عال بما فيه الكفاية ليتم الكشف عن طريق الاتصال المباشر الفلورسنت البروتينات مراسل الانصهار. الثانية، ومن المتوقع أن يكون لها وظائف أساسية فقط مجموعة فرعية صغيرة من الجينات. وتشير التقديرات إلى أن هناك فقط 1،400-2،400 الجينات اللازمة لdevelopme الزردالإقليم الشمالي 15،16. وليس من المتوقع لعرض الظواهر العلني، وبالتالي سيكون لها فائدة محدودة معظم فخ الجين المسوخ. للتغلب على هذه القيود اثنين، ونحن قد عدلت GBT-R15 9،10 للاستخدام مع GAL4-VP16 كما مراسل فخ الجين الأساسي (Balciuniene آخرون قيد الإعداد). كما هو الحال مع AUG-أقل mRFP في GBT-R15، تمت إزالة الموقع بداية الترجمة من GAL4-VP16. للكشف المباشر للأحداث فخ الجينات، ناقلات لدينا تحتوي على مراسل EGFP تحت سيطرة 14X GAL4 UAS 17،18.
صممت العديد من الميزات الإضافية لدينا في ثنائية فخ الجين ناقلات. وUAS: ويحيط EGFP الكاسيت من مواقع FRT المباشر (الاقتباس الرمادي في الشكل 1). حقن FLP recombinase مرنا يؤدي إلى استئصال UAS: EGFP الكاسيت، وترك تحور الجين فخ يشبها EGFP مضان. ويمكن عندئذ أن تستخدم في خطوط المعدلة وراثيا والتي بمناسبة أنسجة معينة أو أحداث التنموية التي كتبها GFP مضان. كما هو الحال في غيرهاGBTs، ويحيط كله فخ الجين الكاسيت من مواقع loxP المباشر (خماسي مفتوحة في الشكل 1). وهذا يجعل الأحداث فخ الجين عكسها من خلال التعبير عن لجنة المساواة العرقية recombinase، وإنشاء بسهولة إثبات العلاقة السببية بين فخ الجين التكامل محددة، ولاحظ النمط الظاهري (الشكل 2). أخيرا، ويحيط فخ الجين الكاسيت من مواقع meganuclease I-SCEI مقلوب (مثلثات سوداء في الشكل 1). في ذبابة الفاكهة، وغالبا ما يتم تحويلها إلى التكامل ينقول الحذف (القصور) من خلال الاستئصال غير دقيقة من العنصر P. لا يوجد أي دليل على أن الختان من Tol2 ينقول (أو أي ينقول الأخرى العاملة في الفقاريات مثل الجمال النائم، PiggyBac أو التيار المتردد / التاءات) يمكن أن يؤدي إلى الحذف. لذا أدرجنا مواقع I-SCEI كوسيلة بديلة محتملة للتحريض والحذف، على الرغم من أنه لا يوجد دليل على أن SCEI I-يمكن أن تحدث الحذف في الزرد. تجدر الإشارة إلى أنه في حين أن SCEI I-الضخمةيمكن استخدامها لتسهيل نقل الجينات نوكلياز في الزرد، ويستخدم الانقسام الحمض النووي عن طريق I-SCEI meganuclease لدراسة آليات إصلاح الحمض النووي، بما في ذلك نهاية غير المتجانسة الانضمام عرضة للخطأ، في الخميرة وخلايا الثدييات 19-22.
التكامل لدينا فخ الجين ناقلات يمكن أن يؤدي إلى EGFP التعبير من خلال آليتين مختلفتين. الأول هو صحيح فخ الجين الحدث (الشكل 1C): ناقلات يدمج الجين (IMG لتحور الجينات Insertionally)، نسخة الانصهار بين 5 'من محضر IMG الذاتية وGAL4-VP16 يرصد ويترجم إلى انصهار بروتين تحتوي على N-محطة من البروتين المشفرة بواسطة وIMG GAL4-VP16. هذا البروتين الانصهار بربط UAS 14X وينشط النسخ من EGFP. الثانية، الحدث اقل من المرغوب فيه هو فخ محسن (الشكل 1D): المروج الحد الأدنى من أمام EGFP يقع تحت سيطرة محسن بالقرب من موقع التكامل، مما يؤدي إلى إنتاج EGFP في أساسهاالعمالي الإنتاج GAL4-VP16. في تقديرنا، 30-50٪ من الأحداث التعبير EGFP هي نتيجة لاعتراض محسن وترجع إلى فخ الجين 23٪ 50-70 (Balciuniene آخرون قيد الإعداد). للتمييز بين هاتين الفئتين من الأحداث، حققنا 14xUAS: mRFP خط المعدلة وراثيا (الشكل 1B)، للراحة تميزت عدسة محددة γCry: (. Balciuniene آخرون قيد الإعداد) GFP. يتم التحقق من الأحداث فخ الجين عن طريق المشاركة في التعبير عن GFP وطلب تقديم العروض (قارن C و D في الشكل 2).
في الشاشة التجريبية لدينا، ونحن تعافى أكثر من 40 فخ الجين الأحداث بعد فحص 270 الأسماك F0 حقن بمزيج من الحمض النووي ينقول وtransposase مرنا. حدثت اثنين من الجينات لدينا فخ التكامل في الجينات مع سبق نشرها المسوخ التي يسببها كيميائيا: جبهة الخلاص الوطني وطنين خط المجال المغنطيسي. الظواهر لدينا المسوخ إقحامي tpl6 جبهة الخلاص الوطني وFLR tpl24 لا يمكن تمييزها بشكل سطحي من النمط الظاهريق من المقابلة المسوخ التي يسببها كيميائيا. لاحظنا أيضا أن أحداث فخ الجينات تظهر منحازة نحو الإنترونات قرب نهاية 5 'من الجينات، وبالتالي زيادة احتمال الأليلات فارغة. نفعل مراقبة درجة معينة من UAS إسكات (تلون) في كل من خطوط فخ الجينات، وبعض مواضع من الواضح أكثر عرضة للتلون من غيرها. نحن لا نعتقد أن UAS إسكات مشكلة كبيرة لانتشار خطوط فخ الجين، كما كنا قادرين على نشر بسهولة كل من خطوط فخ الجينات من خلال خمسة أجيال على الأقل عن طريق اختيار لGFP التعبير وحدها.
Protocol
1. إنتاج الجيل F0 من قبل Microinjection من فخ الجينات.
لقد وجدنا أن الأجنة من خلفيات وراثية مختلفة التحمل عرض مختلفة لهذا الإجراء، مع مقرها الحيوانات الأليفة متجر من النوع البري وتوبنجن - طويل القوائم المالية (TLF) كونها الأكثر تسامحا في حين AB وتوبنغن سلالات لها البقاء على قيد الحياة أكثر فقرا.
- إعداد الحمض النووي ينقول. إعداد GBT-B1 (pDB783، Balciuniene آخرون قيد الإعداد) DNA البلازميد باستخدام معيار عدة QIAprep miniprep (في Qiagen 27106). فمن الضروري أن تشمل الخطوة غسل PB (وهو اختياري في الإجراء QIAprep)، وإلا سوف تكون ملوثة عن طريق الحمض النووي miniprep ريبونوكلياز A، مما أدى إلى تدهور مرنا transposase. قبل الحقن، ويخفف من الحمض النووي في ريبونوكلياز خالية من المياه (AMBION AM9937) إلى 10 نانوغرام / ميكرولتر.
- إعداد transposase مرنا. خطي pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 باستخدام XbaI وتدوين الحمض النووي خطي باستخدام آلة mMessage T3(AMBION AM1348) في المختبر عدة النسخ. قمنا بتعديل رد فعل النسخ في المختبر عن طريق إضافة 0.5 ميكرولتر من RiboLock ريبونوكلياز المانع (ThermoFisher Fermentas EO0381). بعد خطوة الدناز العلاج، وتنقية مرنا باستخدام عدة RNeasy MinElute (في Qiagen 74204). تقييم نوعية في المختبر مرنا كتب بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام. تمييع مرنا في ريبونوكلياز خالية من المياه إلى 40 نانوغرام / ميكرولتر، والمخزن كما مأخوذة 2 ميكرولتر في -80 درجة مئوية.
- إعداد مزيج حقن مكروي. قبل الحقن، إضافة 8 ميكرولتر من الحمض النووي ينقول المخفف للقسامة 2 ميكرولتر من transposase مرنا.
- حقن مكروي. ضخ 3 NL من خليط الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في صفار البيض من 1 الأجنة الزرد الخلية باستخدام تقنيات Microinjection القياسية، وتهدف للواجهة صفار / قسيم أرومي. جمع الأجنة كل 20 دقيقة لضمان حقن في 1 مرحلة الخلية. في تجربتنا، يمكن للشخص ماهرا حقن بسهولة 1،000 الأجنة في 1-1.5 ساعة.
- بعد الحقن، وتشغيل 5 ميكرولتر من اليسارأكثر من حل الحقن على 1٪ هلام الاغاروز لمراقبة الجودة، لضمان أن تكون مرنا transposase لم تتحلل.
- حقن الرعاية الجنين. في وقت متأخر بعد الظهر، وإزالة الأجنة غير مخصبة وغير طبيعي وتوزيع الأجنة إلى 60-80 لكل 100 ملم طبق بيتري. تتم إزالة الأجنة غير الطبيعية والميتة في 1 يوم آخر الإخصاب (DPF)، 2 و 3 DPF DPF.
- الكشف عن GFP التعبير. الأجنة الشاشة من دون عيوب العلني لمضان GFP في 3 DPF (الشكل 3). ويمكن أن يتم الفرز إما على stereomicroscope مجهزة مضان (نستخدم نيكون SMZ1500) أو على مجهر تستقيم (نستخدم زايس AxioImager مع الهدف 5X Fluar). انخفاض التعبير GFP يدل إما حقن فاشلة أو تدهور transposase RNA بسبب التلوث ريبونوكلياز (الشكل 3A). حدد حوالي 30٪ من ألمع الأجنة التي إما GFP التعبير في أنسجة متعددة أو في نسبة عالية من الخلايا من الأنسجة محددة (قارن Figures 3B و 3C). من حقنة من 1،000 الأجنة، لدينا عادة ما يصل الى 100 تنمويا المعتاد،،، معربا عن GFP عالية الأجنة.
- رفع الأجنة F0 المحدد باستخدام إجراءات الزرد تربية القياسية. فمن المعقول أن نتوقع أن 20-30٪ من الأجنة حقن المختارة للتربية والبقاء على قيد الحياة إلى سن البلوغ.
2. صيانة UAS: mRFP تستر الخط.
ونحن قد ولدت 14xUAS: خط mRFP تميزت γCry عدسة محددة: GFP. منذ UAS يخضع لإسكات من خلال الحامض النووي، فمن المهم لتحديد السمك مع مستويات منخفضة من إسكات لنشر سهم.
- إعداد UAS الفردية: أصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل mRFP عن التزاوج مع واحدة من الأكثر موثوقية GAL4 خطوط فخ الجينات لدينا، tpl6 جبهة الخلاص الوطني (Balciuniene آخرون في إعداد).
- في اليوم التالي، ونقل UAS: الأسماك mRFP الذي أعطى الأجنة إلى خزانات ثابتة الفردية، في حين يتم جمع الأجنةوتنظيفها.
- الأجنة الشاشة لGFP ومضان RFP في 1 و 3 DPF DPF.
- الأسماك تزاوج الأقارب الذي أعطى الأجنة مع ارتفاع التعبير mRFP لإنشاء الجيل القادم من UAS: خط mRFP.
3. فحص الأسماك F0.
- عبور F0 الفردية مع UAS متماثل: الأسماك mRFP (الشكل 4). نحن عادة حقن GBTs لدينا في خطوط مع البرية من نوع ليوبارد أو تصبغ أنماط، وUAS متماثل لدينا: خط mRFP في الخلفية النحاس. وبالتالي يمكن GBT حقن الأسماك F0 تمييزها بسهولة من UAS: الأسماك mRFP، مما يلغي الحاجة لتسجيل ما إذا كان يجري فحص F0 كان ذكرا أم أنثى، وكذلك الأخطاء المحتملة الناتجة عن أخطاء في تسجيل و / أو تحديد جنس كل الأسماك. لذا أفراد لديهم خبرة محدودة جدا، مثل لنا طلاب المرحلة الجامعية، قادرين على إعداد وكسر التزاوج الأسماك. هذا النهج لديه عيب أن اثنين من خلفيات وراثية مختلفةتستخدم، ويحتمل أن تعقيد تفسير الظواهر فقدان الوظيفة.
- في اليوم التالي، وعودة UAS النحاس: الأسماك mRFP لدبابتهم. وضع الأسماك F0 الذي أعطى الأجنة في خزانات ثابتة الفردية (نستخدم هاغن إكسو تيرا Faunarium الصغيرة، ولكن أي دبابة صغيرة يمكن استخدامها لهذا الغرض)، في حين يتم جمع الأجنة وفرزهم.
- ونقل الأجنة نظيفة جمعها في أطباق بتري جديدة (<100 في الطبق) في فترة ما بعد الظهر من اليوم 0.
- الأجنة الشاشة لGFP ومضان RFP في 1 DPF، 2 و 3 DPF DPF. سحب الأجنة إيجابية لكلا GFP وطلب تقديم العروض بها، فرزها حسب GFP / نمط التعبير طلب تقديم العروض (إذا لوحظ نمط أكثر من واحد في مخلب) ورفعها إلى إنشاء جيل F1.
- الموت ببطء الأسماك F0 التي أنتجت أجنة السلبية فقط (من أصل العدد الإجمالي للأجنة 50-100).
- عبور الأسماك F0 التي أنتجت GFP / RFP-الإيجابية ذرية مرة أخرى للحصول على الدفعة الثانية من ايجابيات.
4.فحص الأسماك F1.
يتم فحص الأسماك F1 F2 لإقامة العائلات، لتوثيق نمط التعبير الجيني وفخ تجميد دفعات من الأجنة لتحديد الجينات الجزيئية من فخ مواضع بنسبة 5 'RACE والعكسية PCR.
- عبور الأسماك F1 الفردية مع UAS متماثل: الأسماك mRFP (الشكل 4).
- اليوم التالي، ضع السمك F1 التي أعطت أجنة في خزانات ثابتة الفردية في حين يتم جمع الأجنة وفرزهم.
- الأجنة الشاشة لGFP ومضان RFP في 1 DPF، 2 و 3 DPF DPF. الأجنة منفصلة وصورة إيجابية لكلا GFP وطلب تقديم العروض 24.
- في 5 DPF، وتجميد دفعات من 20 GFP / RFP-الإيجابية و20 GFP / RFP الأجنة السلبية لتحديد الجينات المتحولة insertionally بواسطة العكسية PCR و 5 'RACE 9،10. رفع المتبقية GFP / الأجنة طلب تقديم العروض الايجابية لتأسيس الجيل F2.
Representative Results
في حقن ناجحة، لا يقل عن 80٪ من الأجنة حقن فخ الجين DNA / Tol2 transposase المزيج مرنا عرض بعض درجة من GFP مضان (الشكل 3). عندما يتم اختيار ألمع GFP إيجابية الأجنة (الشكل 3C) لإقامة تجمع F0، حوالي واحد في 10 فحص الأسماك F0 سوف تسفر الجين فخ ذرية. بين الأسماك F0 التي يتم استردادها الأحداث فخ الجينات، معظم يحيل فخ الجين حدث واحد، بالإضافة إلى العديد من غير معربا-التكامل ينقول. ومع ذلك، وضعنا ما يصل إلى أربعة خطوط فخ الجينات من فرد واحد F0. GFP / RFP أنماط التعبير في خطوط فخ الجينات تتراوح من غاية محددة الأنسجة (على سبيل المثال في بصيلات الشم) إلى كل مكان إلى حد ما.
الشكل 1. Tانه GAL4 التي تحتوي على الجين فخ ثنائية ناقلات GBT B1 وتطبيقاتها. A. مكونات GAL4 التي تحتوي على الجين ناقلات فخ: Tol2 5 'وTol2 3'، والحد الأدنى Tol2 ينقول ينتهي 13؛ كالة الفضاء الكندية، شبوط β-أكتين لصق متقبل 8؛ ^ GAL4-VP16، AUG-أقل GAL4-VP16؛ ZP ( A)، β-أكتين الزرد 3 'UTR وبولي (A) عناصر من GBT-R15 9،10. 14XUAS، EGFP وSV40 ص (A) هي مكونات UAS: EGFP التعبير كاسيت 17،18. السهم يشير تفعيل UAS: EGFP بواسطة GAL4-VP16 التي تنتجها الجينات فخ باء 14XUAS: mRFP التحوير تميزت γCry عدسة محددة: الكاسيت GFP. السهم يشير تفعيل UAS: mRFP بواسطة GAL4-VP16 في فخ الحدث عبر C. الجينات. صناديق الزرقاء هي الإكسونات. يشار إلى الربط عن طريق خط متقطع. فخ الحدث D. محسن. التكامل بين ناقلات قرب محسن (مربع البني) قد وضع الحد الأدنى EGFP المروج تحت سيطرة هذا محسن (السهم البني ). هذا من شأنه أن يؤدي إلى التعبير الأنسجة محددة من EGFP، ولكن لأنه لا يتم GAL4-VP16، لن يتم تفعيلها mRFP التعبير.
الشكل 2. الارتداد من الأحداث فخ باستخدام الجينات لجنة المساواة العرقية recombinase. A، B. رسم توضيحي لطفرة الجين فخ (A) وعادت لجنة المساواة العرقية فخ الجين أليل (B). C، D. المشارك التعبير عن GFP (C) وطلب تقديم العروض (D) في الجهاز العصبي من الجين tpl6 جبهة الخلاص الوطني مصيدة الخط. E، F. حقن الحمض النووي الريبي لجنة المساواة العرقية في الأجنة tpl6 جبهة الخلاص الوطني يؤدي إلى فقدان GFP (E) وطلب تقديم العروض (F) التعبير. لاحظ أنه لا يوجد أي تخفيض GFP التعبير في العدسة، كما هو متوقع.
r.within صفحة = "دائما"> 
الرقم 3. حقن الأجنة مع GBT-B1 (pDB783) فخ الجينات. . حقن A. الأجنة مع pGBT-B1 (pDB783) وحدها العرض قليلا مضان GFP في الجسم B، C. حقن الأجنة مع pGBT-B1 وTol2 transposase مرنا: مجموعة عشوائية من الأجنة (B) وexpressors عالية اختيارها لتربية (C).
الشكل 4. مخطط تجريبي لإنشاء خطوط GAL4 فخ الجينات. هياكل أحمر / أخضر متداخلة جزئيا تشير شارك التعبير عن GFP من وكراسة الشروط، في حين الخضراء وحدها تشير الاصباغ لفخ الجينات أو فخ محسن الأحداث.
Discussion
ويجري بالفعل استخدام ناقلات فخ الجينات والمنهجية الموضحة هنا في عدة مختبرات مستقلة. في تجربتنا، وهناك نوعان من الخطوات الحاسمة في هذه العملية. الخطوة الحاسمة الأولى لتحقيق معدلات عالية من فخ الجينات في الأجنة التكامل F0 حقن. يمكن في كثير من الأحيان أن يعزى الفشل في هذه الخطوة إلى تلوث ريبونوكلياز من الكواشف الحقن، وخاصة الحمض النووي miniprep. بل هو أيضا مهم جدا لحقن الأجنة في مرحلة 1 خلية لفخ الجين التجارب. في تجربتنا، ونقل الجينات Tol2 بوساطة فعالة جدا، مما يجعل من الممكن الحصول على خطوط المعدلة وراثيا حتى عندما حقن في وقت لاحق من المرحلة 1 الخلية أو الحمض النووي مع أقل جودة. الحقن هي دون المستوى المطلوب أكثر تعقيدا من ذلك بكثير عند إجراء فخ الجينات الطفرات، لأن سوى جزء صغير من التكامل ناقلات يؤدي إلى الأحداث فعالة فخ الجينات. الخطوة الحاسمة الثانية هي للتأكد من فخ الأحداث الجين عن طريق عبور لدينا UAS: خط mRFP. غياب mRFP التعبيردائما تقريبا مما يشير إلى حدوث الحدث فخ محسن. ومع ذلك، وأحيانا عدم وجود mRFP التعبير قد يشير إلى إسكات UAS 14X. ولذا فمن المهم للحفاظ على UAS: خط mRFP في حالة غير أسكتهما نشر الجيل المقبل باستخدام الأفراد مع طلب تقديم العروض عالية التعبير عندما عبرت لtpl6 جبهة الخلاص الوطني.
يمكننا أن نتوقع اتخاذ العديد من التحسينات لدينا فخ الجين ناقلات والبروتوكول. الأول هو استخدام UAS أقل تكرارا في فخ الجينات بناء. فقد تبين أن 5X UAS كافية لتحقيق التفعيل الكامل في تجارب زراعة الخلايا، والتي متواليات UAS أقل تكرارا هي أقل عرضة للمثيلة وإسكات 6،25. قد يكون من الممكن أيضا لتصميم مصيدة الجين ناقلات للالطفرات مشروطة تماما، تشبيها له النواقل المستخدمة من قبل الماوس الدولي فخ الجين كونسورتيوم مؤخرا وتكييفها لالزرد 2،26،27. سوف تحسن آخر يتمثل في استخدام ر مختلفةنظام ransposon، على سبيل المثال الجمال النائم 28، لتوليد UAS: mRFP خط مراسل. وهذا من شأنه تمكين حقن الجينات الفخاخ مقرها Tol2 مباشرة في خط مراسل والفرز من قبل F0s incrossing. وعلاوة على ذلك، فإن هذا القضاء على استخدام اثنين من خلفيات وراثية مختلفة، مما يجعل تفسير الظواهر فقدان وظيفة أكثر وضوحا. حتى مع هذه التحسينات، فإن العام GAL4 فخ الجين بروتوكول المعروضة هنا لا تزال مطبقة تطبيقا كاملا.
Disclosures
هؤلاء الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر الدكتورة جنيفر Emtage لقراءة نقدية للمخطوطة، ريان جيل للحصول على المساعدة الفنية والمساعدة في رعاية الزرد والدكتور ستيفن C. Ekker (مايو كلينيك، Rochster، مينيسوتا) للمواد. وقد تم دعم عملنا معبد كلية جامعة العلوم والتكنولوجيا والمعاهد الوطنية للصحة (R01-HD061749).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Optional PB wash step is a must |
| XbaI restriction enzyme | ThermoFisher | ER0681 | |
| mMessage Machine T3 | Ambion | AM1348 | |
| RiboLock RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNeasy MinElute | Qiagen | 74204 | Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl! |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | Has to be non-DEPC treated |
| Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microcapiliaries for calibration | Drummond Scientific | 1-000-0010 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Needle puller * | Sutter Instruments | P-87 | |
| Stereomicroscope for microinjection * | Nikon | SMZ1500 | We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand |
| Picoinjector * | Harvard Instruments | Pli-90 | We also use Pli-100 |
| Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Zeiss | Zeiss AxioImager | 5X Fluar objective has sufficient working distance |
| Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Nikon | SMZ1500 | |
| * We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available. | |||
References
- Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).
- Trinh le, A., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Emelyanov, A., Parinov, S. Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression in transgenic zebrafish. Dev Biol. 320 (1), 113-121 (2008).
- Ellingsen, S., et al. Large-scale enhancer detection in the zebrafish genome. Development. 132 (17), 3799-3811 (2005).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).
- Davison, J. M., et al. Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish. Dev Biol. 304 (2), 811-824 (2007).
- Sivasubbu, S., et al. Gene-breaking transposon mutagenesis reveals an essential role for histone H2afza in zebrafish larval development. Mech Dev. 123 (7), 513-529 (2006).
- Clark, K. J., et al. In vivo protein trapping produces a functional expression codex of the vertebrate proteome. Nat Methods. 8 (6), 506-512 (2011).
- Petzold, A. M., et al.
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383 (6603), 829-832 (1996).
- Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22 (9), 473-478 (2006).
- Balciunas, D., et al. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169 (2006).
- Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mech Dev. 80 (2), 153-158 (1999).
- Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol Cell Biol. 14 (12), 8096-8106 (1994).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
- Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair. PLoS Genet. 4 (6), e1000110 (2008).
- Rehn, K., Wong, K. S., Balciunas, D., Sumanas, S. Zebrafish enhancer trap line recapitulates embryonic aquaporin 1a expression pattern in vascular endothelial cells. Int J Dev Biol. 55 (6), 613-618 (2011).
- Petzold, A. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish. Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).
- Boniface, E. J., Lu, J., Victoroff, T., Zhu, M., Chen, W. FlEx-based transgenic reporter lines for visualization of Cre and Flp activity in live zebrafish. Genesis. 47 (7), 484-491 (2009).
- Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36 (6), 543-544 (2004).
- Davidson, A. E., et al. Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).
