Molecular Imaging til Target transplanterte Muscle stamceller
Summary
En ikke-invasiv måte å vurdere effekten av myoblast transplantasjon er beskrevet. Metoden benytter seg av det enhetlig fusion rapportørgen sammensatt av gener hvis ekspresjon kan avbildes med forskjellige imaging modaliteter. Her benytter vi en<em> Svingninger</em> Reporter gensekvens til målceller via bioluminescens imaging.
Abstract
Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en alvorlig genetisk nevromuskulær lidelse som rammer 1 av 3500 gutter, og er preget av progressiv muskel degenerasjon 1, 2. Hos pasienter, blir evnen til bosatt muskel satellitt celler (SC) for å regenerere ødelagte myofibers stadig ineffektiv 4. Derfor er transplantasjon av muskel stamceller (MPCs) / myoblasts fra friske forsøkspersoner en lovende terapeutisk tilnærming til DMD. En viktig begrensning for bruken av stamcelleterapi, derimot, er en mangel på pålitelige bildebehandlingsteknologier for langsiktig overvåking av implanterte celler, og for å vurdere effektiviteten. Her beskriver vi en ikke-invasiv, real-time tilnærming for å vurdere effekten av myoblast transplantasjon. Denne metoden tar fordel av en enhetlig fusion reporter genet består av gener (firefly luciferase [svingninger], monomere rød fluorescerende protein [mrfp] og sr39 tymidinkinase [sr39tk]) hvis expression kan avbildes med forskjellige bildediagnostikk 9, 10. En rekke bildediagnostikk, inkludert positronemisjonstomografi (PET), single-foton emisjon computertomografi (SPECT), magnetisk resonans imaging (MRI), optisk bildebehandling og høy frekvens 3D-ultralyd er nå tilgjengelig, hver med unike fordeler og begrensninger 11. Bioluminescens imaging (BLI) studier, for eksempel, har den fordelen av å være relativt lav kostnad og høy gjennomstrømning. Det er av denne grunn at i denne studien, gjør vi bruk av firefly luciferase (svingninger) reporter gensekvensen inneholdt i fusion genet og Bioluminescens imaging (BLI) for den kortsiktige lokalisering av levedyktige C2C12 myoblasts etter utsetting i en mus modell av DMD (muskeldystrofi på X-kromosomet [MDX] mus) 12-14. Viktigst, gir BLI oss med et middel for å undersøke kinetikken av merket MPCs etter implantasjon, og vil være nyttig for å spore celler gjentatte ganger over time og følgende migrasjon. Vår reporter genet tilnærming videre tillater oss å slå sammen flere bildediagnostikk i en enkelt levende faget, gitt tomographic natur, fine romlig oppløsning og evne til å skalere opp til større dyr og mennesker 10,11, vil PET danne grunnlaget for det videre arbeidet at vi foreslår kan rette for rask oversettelse av metodene som er utviklet i celler til prekliniske modeller og kliniske applikasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien har vi beskrevet en rask og pålitelig molekylær imaging, reporter genet tilnærming til ikke-invasiv målet myoblasts / MPCs etter en transplantasjon. Mens denne studien viser kortsiktige lokalisering av transplanterte MPCs via bioluminescense imaging (BLI), på hvilken måte celler målrettet kan faktisk lett påføres en langsgående vurdering av celle engraftment gjennom implantasjon av celler som stabilt uttrykte reporteren genet. For dette formål, har vår gruppe generert transg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Sanjiv Gambhir for gaven av fluc/mrfp/sr39tk reporter genet. Dette arbeidet ble finansiert av Stem Cell Network (SCN) i Canada, og The Jesse Journey Foundation.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. Lancet. 359, 687-695 (2002).
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D. Muscle stem cells. J. Pathol. 197, 457-467 (2002).
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Moss, F. P., Leblond, C. P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).
- Snow, M. H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).
- Hoffman, E. P., et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne’s or Becker’s muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).
- Ray, P., et al. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Mattson, M. P. . Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, 294 (2001).
- Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse. J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).
