Molecular Imaging till Target transplanterade celler Muscle stamfader
Summary
En icke-invasiv sätt att utvärdera framgång myoblast transplantation beskrivs. Metoden utnyttjar en enhetlig fusion reportergen som består av gener vars uttryck kan avbildas med olika avbildningsmetoder. Här använder vi oss av en<em> Fluc</em> Reportergen sekvens till målceller via bioluminiscens avbildning.
Abstract
Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en allvarlig genetisk neuromuskulär sjukdom som drabbar 1 av 3.500 pojkar, och kännetecknas av progressiv muskeldegeneration 1, 2. Hos patienter blir förmågan hos inhemska muskelceller satellit (SCS) för att regenerera skadade myofibers allt ineffektiv 4. Därför är transplantation av muskelceller stamceller (Medelhavsländerna) / myoblaster från friska försökspersoner en lovande terapeutiskt förhållningssätt till DMD. En stor begränsning för användningen av stamcellsterapi är dock en brist på tillförlitliga imaging teknik för långsiktig övervakning av implanterade celler, och för att utvärdera dess effektivitet. Här beskriver vi en icke-invasiv, realtid strategi för att utvärdera framgång myoblast transplantation. Denna metod utnyttjar en enhetlig fusion reportergen bestående av gener (eldflugeluciferas [Fluc], monomert röd fluorescerande protein [mrfp] och sr39 tymidinkinas [sr39tk]) vars expression kan avbildas med olika avbildningsmetoder 9, 10. En mängd avbildningsmetoder, inklusive positronemissionstomografi (PET), single-photon emission datortomografi (SPECT), magnetisk resonanstomografi (MRT), optisk avbildning, och högfrekvent 3D-ultraljud finns nu, var och en med unika fördelar och begränsningar 11. Bioluminescens imaging (BLI) studier, till exempel, har fördelen av att vara relativt låg kostnad och hög genomströmning. Det är av denna anledning som, i denna studie, vi utnyttjar eldflugeluciferas (Fluc) reportergen sekvens som finns i fusionsgenen och bioluminescens imaging (BLI) på kort sikt lokalisering av livskraftiga C2C12 myoblaster efter implantation i en mus modell av DMD (muskeldystrofi på X-kromosomen [MDX] mus) 12-14. Viktigt ger BLI oss ett sätt att undersöka kinetiken för märkta Medelhavsländerna efter implantation, och kommer att vara användbart för att spåra celler upprepade gånger under tIME och följande migration. Vår reportergen ännu längre tillåter oss att slå ihop flera avbildningsmetoder i en enda levande varelse, med tanke på tomografiska natur, fina spatial upplösning och förmåga att skala upp till större djur och människor 10,11, kommer PET att ligga till grund för framtida arbete som vi föreslå kan underlätta en snabb översättning av metoder som utvecklats i celler till prekliniska modeller och kliniska tillämpningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie har vi beskrivit en snabb och pålitlig molekylär avbildning, tillvägagångssätt reportergen för icke-invasiva mål myoblaster / Medelhavsländerna efter transplantation. Även denna studie visar på kort sikt lokalisering av transplanterade Medelhavsländerna via bioluminescense avbildning (BLI), det sätt på vilket celler riktade kan i själva verket lätt att en längsgående bedömning av cell ympning tillämpas genom implantation av celler som stabilt uttrycker reportergenen. I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Sanjiv Gambhir för gåva fluc/mrfp/sr39tk reportergenen. Detta arbete har finansierats av stamceller Network (SCN) i Kanada och Jesse färd Foundation.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. Lancet. 359, 687-695 (2002).
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D. Muscle stem cells. J. Pathol. 197, 457-467 (2002).
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Moss, F. P., Leblond, C. P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).
- Snow, M. H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).
- Hoffman, E. P., et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne’s or Becker’s muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).
- Ray, P., et al. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Mattson, M. P. . Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, 294 (2001).
- Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse. J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).
