의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
우리는 중추 신경 시스템에 하나의 뉴런을 라벨에 대한 기술 (CNS)의 제시<em> Drosophila</em> 전송 빛 또는 공 촛점 현미경에 의해 neuronal 형태의 분석을 허용 배아.
Abstract
이 글에서 우리는 개별적으로 lipophilic 형광 막 마커 DiI의 juxtacellular 주입에 의한 Drosophila melanogaster의 배아 CNS의 뉴런에 레이블을하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 아주 자세히 neuronal 세포 형태의 시각화 할 수 있습니다. 그것은 CNS에있는 셀에 레이블을 할 수 있습니다 : 대상 뉴런의 세포 기관은 DIC 광학에서 또는 GFP 등의 형광 유전자 마커의 표현으로 시각화 수 있습니다. 라벨 후, DiI는 전송 빛과 DIC 광학으로 세포 형태의 시각화를 허용하도록 photoconversion하여 영구적 인 갈색 얼룩로 변환 할 수 있습니다. 또는 DiI – 라벨 세포는 유전자 도입 형광 기자 단백질이 colocalised 할 수 있도록, 공 촛점 현미경과 직접 관찰 할 수 있습니다. 기술은이 가능 단세포 해상도 돌연변이 phenotypes을 분석하고, 관계없이 유전자형의 모든 동물에서 사용할 수 있습니다.
Introduction
개별 셀의 수준에서 neuronal 형태의 지식은 neuronal 연결 및 CNS 기능을 이해하는 중요한 전제 조건이다. 따라서, 신경 과학의 초기에서, 연구자는 단일 셀 라벨 기술 (이 문제의 역사적인 치료 7 참조) 개발을 모색하고있다. 이러한 Golgi의 착색 등의 고전 방법은 neuronal 형태의 우수한 해상도를 제공하지만, 하나는 착색이 임의의 방식으로 발생 등의 이동 방법으로 신경 세포의 특정 유형의 라벨을 추구하는 경우 적합하지 않습니다. microelectrode에서 염료의 세포 또는 juxtacellular 주입하여 단일 세포를 얼룩위한 방법의 개발은 특정 상표의 요구 사항을 해결.
Drosophila에 하나의 뉴런 염료 주입의 응용 프로그램 때문에 유기체와 뉴런 모두의 작은 크기, 큰 도전을 제시. 배아 Drosophila의 그럼에도 불구하고, 단일 신경 세포의 착색 </em> 뉴런은 코리 굿맨 (15)의 연구실에서 1980 년대 중반에 달성되었다. 방법은 eminently 유용하고 지난 20~30년 (예 : 2, 10) 이상 Drosophila의 neuronal 개발을위한 메커니즘으로 몇 가지 주요 통찰력을 제공하고 있지만, 많은 근로자는 주로 때문에 기술적 요구의 그것과 떨어져 shied했습니다.
Drosophila의 neuronal 라벨에 유전자 기술의 최근 몇 년 동안 사용 가능 여부는 하나의 신경 세포의 색소 주입의 unpopularity에 공헌하고 있습니다. 막 타겟 GFP 구조의 GAL4-지시 표현은 신경 형태 1, 20 뛰어난 해상도를 제공 할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 특정 제한이 있습니다 : 여러 셀에 GFP의 자주 불가피한 표현은 개별 뉴런의 구조를 가리 수 있으며 GAL4 드라이버 라인은 관심의 특정 신경 세포에 표현을 유도 할 수되지 않을 수 있습니다. MARCM (담당자와 모자이크 분석ressible 세포 마커) 방법 8은 개별 세포 수준에서 본질적으로 어떤 신경 세포의 라벨 있지만, 성공적으로 인해 GAL80 단백질의 느린 매출의 배아와 초기 유충에 사용할 수 없습니다를 제공 할 수 있습니다.
유전자 라벨 이러한 제한을 감안할 때, 우리는 Drosophila의 배아에서 해당 단일 신경 세포의 색소 주입이 귀중한 기술을 유지하고 폭 넓은 응용을받을 권리가 생각합니다. 이러한 목표를 촉진하기 위해, 우리는 여기 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 힘의 그림은 후반 Drosophila의 배아 (14)의 복부 neuromeres의 interneurons의 전체 세트의 형태와 우리의 최근 계정에 의해 제공됩니다. 개인 neuronal 세포 유형의 형태학의 다양성과 배의 CNS에서 neuromere 조직의 원리를 모두 공개이 연구는 다른 현재 분류 방법으로 불가능했을 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
모델 시스템으로 Drosophila 중 하나 큰 장점은 단일 세포 수준의 개발과 기능의 분석을 허용한다는 것입니다. 이 세포 유형의 다양성이 매우 높은이며, 이웃 세포의 기능과 형태가 완전히 다를 수 신경계에 관한 특히 유용합니다.
우리가 여기서 제시하는 방법 중 하나 영구적 인 얼룩이나 형광 현미경에 의해 직접 검사로 변환 할 수있는 염료 개별 뉴런의 라벨 수 있습니…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 DFG에서 그리니치 표준시로 보조금에 의해 지원되었다
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DAB | Sigma-Aldrich | D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
| DiI | Invitrogen/Molecular Probes | D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
| Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
| Glycerol | Roth | 3783 | 70% in PBS |
| Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
| PBS | 1x | ||
| TRIS | Roth | 4855 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
| DC – amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
| Coverslips | Menzel | BB018018A1 | 18 x 18 mm |
| Coverslips | Menzel | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
| Flat Capillaries | Hilgenberg | outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
| Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
| Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
| Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
| Object Slides | Marienfeld Superior | 1000000 | |
| Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
| Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
| Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1.
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron. Dev. Suppl. , 227-238 (1993).
- Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. . The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures. J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67, 45-57 (1991).
- Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages. Development. 139, 2510-2522 (2012).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Levick, W. R. Another tungsten microelectrode. Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).
- Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations. Cell. 81, 631-639 (1995).
- Murray, M. J., Whitington, P. M. Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile. Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).
- Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron. J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).
- Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development. Nature. 310, 203-207 (1984).
- Whitington, P., Harris, K. Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata. Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).
- Whitington, P., Meier, T. Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt). Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).
- Whitington, P. M., Seifert, E. Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery. Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).
- Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans. Development. 118, 449-461 (1993).
- Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).
