Summary
우리는 중추 신경 시스템에 하나의 뉴런을 라벨에 대한 기술 (CNS)의 제시
Abstract
이 글에서 우리는 개별적으로 lipophilic 형광 막 마커 DiI의 juxtacellular 주입에 의한 Drosophila melanogaster의 배아 CNS의 뉴런에 레이블을하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 아주 자세히 neuronal 세포 형태의 시각화 할 수 있습니다. 그것은 CNS에있는 셀에 레이블을 할 수 있습니다 : 대상 뉴런의 세포 기관은 DIC 광학에서 또는 GFP 등의 형광 유전자 마커의 표현으로 시각화 수 있습니다. 라벨 후, DiI는 전송 빛과 DIC 광학으로 세포 형태의 시각화를 허용하도록 photoconversion하여 영구적 인 갈색 얼룩로 변환 할 수 있습니다. 또는 DiI - 라벨 세포는 유전자 도입 형광 기자 단백질이 colocalised 할 수 있도록, 공 촛점 현미경과 직접 관찰 할 수 있습니다. 기술은이 가능 단세포 해상도 돌연변이 phenotypes을 분석하고, 관계없이 유전자형의 모든 동물에서 사용할 수 있습니다.
Introduction
개별 셀의 수준에서 neuronal 형태의 지식은 neuronal 연결 및 CNS 기능을 이해하는 중요한 전제 조건이다. 따라서, 신경 과학의 초기에서, 연구자는 단일 셀 라벨 기술 (이 문제의 역사적인 치료 7 참조) 개발을 모색하고있다. 이러한 Golgi의 착색 등의 고전 방법은 neuronal 형태의 우수한 해상도를 제공하지만, 하나는 착색이 임의의 방식으로 발생 등의 이동 방법으로 신경 세포의 특정 유형의 라벨을 추구하는 경우 적합하지 않습니다. microelectrode에서 염료의 세포 또는 juxtacellular 주입하여 단일 세포를 얼룩위한 방법의 개발은 특정 상표의 요구 사항을 해결.
Drosophila에 하나의 뉴런 염료 주입의 응용 프로그램 때문에 유기체와 뉴런 모두의 작은 크기, 큰 도전을 제시. 배아 Drosophila의 그럼에도 불구하고, 단일 신경 세포의 착색 (15)의 연구실에서 1980 년대 중반에 달성되었다. 방법은 eminently 유용하고 지난 20~30년 (예 : 2, 10) 이상 Drosophila의 neuronal 개발을위한 메커니즘으로 몇 가지 주요 통찰력을 제공하고 있지만, 많은 근로자는 주로 때문에 기술적 요구의 그것과 떨어져 shied했습니다.
Drosophila의 neuronal 라벨에 유전자 기술의 최근 몇 년 동안 사용 가능 여부는 하나의 신경 세포의 색소 주입의 unpopularity에 공헌하고 있습니다. 막 타겟 GFP 구조의 GAL4-지시 표현은 신경 형태 1, 20 뛰어난 해상도를 제공 할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 특정 제한이 있습니다 : 여러 셀에 GFP의 자주 불가피한 표현은 개별 뉴런의 구조를 가리 수 있으며 GAL4 드라이버 라인은 관심의 특정 신경 세포에 표현을 유도 할 수되지 않을 수 있습니다. MARCM (담당자와 모자이크 분석ressible 세포 마커) 방법 8은 개별 세포 수준에서 본질적으로 어떤 신경 세포의 라벨 있지만, 성공적으로 인해 GAL80 단백질의 느린 매출의 배아와 초기 유충에 사용할 수 없습니다를 제공 할 수 있습니다.
유전자 라벨 이러한 제한을 감안할 때, 우리는 Drosophila의 배아에서 해당 단일 신경 세포의 색소 주입이 귀중한 기술을 유지하고 폭 넓은 응용을받을 권리가 생각합니다. 이러한 목표를 촉진하기 위해, 우리는 여기 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 힘의 그림은 후반 Drosophila의 배아 (14)의 복부 neuromeres의 interneurons의 전체 세트의 형태와 우리의 최근 계정에 의해 제공됩니다. 개인 neuronal 세포 유형의 형태학의 다양성과 배의 CNS에서 neuromere 조직의 원리를 모두 공개이 연구는 다른 현재 분류 방법으로 불가능했을 것입니다.
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Protocol
우리는 우리의 실험실에서 단일 신경 세포의 라벨 방식의 두 약간 다른 변종을 사용했습니다. 차이는 배아의 수집, dechorionisation, devitellinisation 및 배아 시체를 저민 단계에 관한 것이다. 그림 1은 변종의 공동와 발산 단계에 대한 개요를 제공합니다.
1. 염료 주입을위한 배아 해부 및 Micropipettes를위한 마이크로 바늘의 작성
- 배아 해부 용 유리 바늘은 셔터 풀러 (과학 계측기) 또는 유사한 장비로 유리 모세관 (1 밀리미터 직경 0.1 mm 벽 두께)에서 차출됩니다. 또한, 바늘 홀더에 장착 electrolytically 날카롭게 0.15 mm의 텅스텐 와이어는 dissections에 사용됩니다. (선명하게 전해 대한 지침은 9 주어집니다).
- 셔터 풀러 (과학으로, 염료 사출 micropipettes은 내부 필라멘트 (GB 100 TF 8P 과학 제품)과 얇은 벽 유리 모세 혈관에서 차출됩니다계측기) 또는 유사한 장비. micropipette 팁은 배의 조직 통과를 돕기위한 칼의 점진적이고 균일 한 테이퍼과 날카로운 있어야합니다. 원하는 micropipette는 셔터 악기 피펫 요리 책 설명서 (의 p.20에 설명 된 "높은 저항 Microelectrode, 샤프와 롱"다양한입니다 http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ). 주사는 자신의 팁이 샤프하고 깨끗한 유지하기 위해 수행되기 전에 일반적으로, micropipettes이 곧 당겨 있습니다.
2. 수집, 장착 및 태아의 해부
- 배아 컬렉션. 우리는 성공적으로 신경 세포 주입 방법을 사용한 17 3 단계 12에서 배아 여기 설명했다. 태아는 점점 무대 17시 큐티클을 개발하고 해부가 점점 더 어려워집니다. 두 가지 대체 방법은 그들을받을 수 있습니다특정 발달 단계에서 bryos.
- 파리는 효모 붙여 넣기 코팅 사과 주스 - 한천 플레이트에 밤새 산란 할 수 있습니다. 분사의 계획 시간을 다음 날에 맞게 계란 컬렉션의 온도를 조정합니다. 다음 날 모든 계란을 수집하고 형태학의 기준에게 3를 사용하여 원하는 단계에서 배아를 선택합니다.
- 파리는 위와 같이 한천 플레이트에 누워 있지만, 25 새로운 사람이에요 1.5 시간 ° C.와 한천 플레이트를 교환 할 수 있도록 허용 배아는 발달 단계는 필요에 도달 할 때까지, 정의 기간에 대한 각각의 판을 품다.
- 화학 Dechorionation. 한천에서 배아를 데리고 약 10 ML Drosophila 벨소리 또는 인산이 생리 (PBS) 솔루션을 버퍼 포함 된 유리 용기 (예 : 페트리 접시 캐비티 블록)으로 전송하기 위해 금속 주걱을 사용합니다. 농축 표백제 몇 방울을 추가하고에 몇 분 동안 활발히 논의배아에서 융모막의 sloughs 때까지 회전 플랫폼입니다. 잔류 표백제를 전혀 냄새가 없을 때까지 벨소리 / PBS의 여러 변화 배아를 씻으십시오. 이 세차하는 동안 배아는 액체 표면과 접촉하지 않도록. 그렇지 않으면, 그들은 떠 나중에 조작을 위해 잠수함하기가 어렵 될 것입니다. 또한, 화학 dechorionation은 4에 기술 된 바구니 기술을 사용하여 수행 할 수 있습니다.
- 기계 dechorionation은 (그림 2 참조, 1-4 단계). 전송 배아를 한천 플레이트에서 양면 스티커 테이프로 덮여 슬라이드에. 가 테이프에 대한 그들의 접착을 방해하므로 태아와 한천를 전송하지 마십시오. 융모막는 약간 부서지기 쉬운 때까지 배아는 5 10 분 동안 건조 할 수 있습니다. (기다리는 동안, 코트 접착제로하기 devitellinisation에 필요한 coverslip은 - 아래 2.3B 참조). 바늘로 조심스럽게 각 배아를 터치합니다. 융모막 오픈 분할되고 난자는 NE에 집중합니다edle. 즉시 직면 한 자신의 복부 측면과 함께 행에 그 10에 대한 건조를 방지하고 정렬 할 수있는 한천 블록에 전송 배아.
Devitellinisation과 시체를 저민는 2.3A와 2.3B에서 설명하는 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 수동으로 이루어집니다.
- 벨소리 솔루션의 요리에서 미리 준비된 현미경 슬라이드에 실리콘 댐의 벨소리의 여러 물방울에 적절한 발달 단계의 단일 dechorionated 배아를 전송합니다. (번짐 현미경 슬라이드에 실리콘 밀봉 제의 얇은 층에 의해 3cm 정사각형 댐을 확인한 후 댐의 중앙에 0.01 % 폴리-L-라이신 솔루션의 한 방울을 추가합니다. 실리콘은 24 시간에 치료하도록 허용합니다.) 배아는 전송 중에 벨소리의 표면 아래에 남아 있도록, 유리 파스퇴르 피펫으로 배아를 전송합니다.
동안 부드럽게 squeez, 고급 포셉 한 쌍의 배의 뒤쪽 끝을 단단히그 앞쪽 끝에서 다시 분기에 관해, 고급 iridectomy 가위 한 쌍의 방법을 배아를 들죠. 배아을 통과 절단하지 마십시오. 목적은 배아에 최소한의 손상을 초래 불과 vitelline 막를 깨서하는 것입니다. 아직 위치에 포셉과 함께 슬라이드에 열려있는 막과 위치 그걸 복부 쪽을 배아를 알아 완화하기 위해 텅스텐 바늘을 사용합니다. 난자는 폴리 라이신 코트에 충실해야합니다.
날카롭게 텅스텐 바늘로 등심 배. 부드럽게 구멍이 다음 등쪽의 중간 선을 따라 몸의 벽을 찢어. 이 슬라이드에 붙어 있도록 바늘 사용하여 몸의 벽에 아래로 밀어. 몸의 벽에 손상을 방지하기 위해 한 후 바늘 사이에 interposed 직감과 몸의 벽을 밀어. 다음의 앞쪽과 뒤쪽 끝에서 내장을 찢어하고 거리에 들어하는 바늘을 사용합니다. 원하는 경우 추가 배아는 동일한 슬라이드로 이동 devitellinised과 filleted 이미의 다른 배아를 손상하지 않도록 조심하는 것슬라이드. - 코트 슬라이드의 중앙에 접착제의 작은 방울을 배치하고 매우 얇은 필름 18 X 18mm의 coverslip으로 확산하여 헵탄 접착제 (표 1 참조)가있는 24 X 60mm의 coverslip. 현미경 슬라이드에 coverslip을 배치하고 가장자리 주변의 일방적 접착 테이프의 프레임을합니다. 10 배아의 행을 가지고있는 블록에서 초과 한천을 떼어, 부드럽게 coverslip 헵탄 접착제 coverslip으로 배아를 터치합니다. 그들은 당장 직면 한 자신의 복부 측면과 함께 coverslip을 준수해야합니다. (그림 2 참조, 4-6 단계를) 배아를 커버하기 위해 PBS의 관대 한 금액을 추가합니다.
그 뒤 끝 부분 각 배아의 등면에 유리 또는 텅스텐 바늘로 vitelline 막에 침투. 등쪽의 중간 선을 따라 멤브레인을 열고 찢어하고 막의 배아를 드래그합니다. 동양 곳 헵탄 접착제 기판과 등심은 2.3A에서 설명한 것과 동일한 방법을 사용하는 방법에 대한 아래 배아 복부 쪽) (참조그림 2) 7-8 단계를 반복합니다. 여러 배아가 같은 슬라이드에 filleted되기 때문에, 나도 자신의 방향으로 매우 정확하거나 슬라이드에 자신의 방향의 그림을 만들기 위해 도움이 될 것입니다.
- 벨소리 솔루션의 요리에서 미리 준비된 현미경 슬라이드에 실리콘 댐의 벨소리의 여러 물방울에 적절한 발달 단계의 단일 dechorionated 배아를 전송합니다. (번짐 현미경 슬라이드에 실리콘 밀봉 제의 얇은 층에 의해 3cm 정사각형 댐을 확인한 후 댐의 중앙에 0.01 % 폴리-L-라이신 솔루션의 한 방울을 추가합니다. 실리콘은 24 시간에 치료하도록 허용합니다.) 배아는 전송 중에 벨소리의 표면 아래에 남아 있도록, 유리 파스퇴르 피펫으로 배아를 전송합니다.
- 시체를 저민 후, 배아는 가볍게 PBS에 7.4 %의 포름 알데히드에 10-15 분 동안 고정 될 수 PBS에 4 세차에 이어. 극단적 인 치료는 표면 장력의 힘은 배아를 파괴되므로,이 과정에서 솔루션의 표면과 접촉으로 배아를 가지고하지 않도록해야합니다. 이 사전 고정 단계는 엄격하게 필요하지 않습니다,하지만 후반 단계 배아에 몸 벽 근육의 수축을 방지하기 위해 젊은 단계에서 배아 조직을 안정화하기 위해 유용합니다. 고정은 DIC 관찰 아래에있는 배아의 조직이 더 불투명 등 다소 타협 이미지 품질 확인 않는다는 것을 명심하십시오.
3. 사출 Micropipettes의 작성
반으로 0.5 ML Eppendorf microfuge 관을 작성100 % 에탄올에 carbocynanine 염료 DiI (분자 프로브, 유진, OR) (DiI 침전을 피하기 위해 '건조'절대 EtOH를 사용해야합니다)의 0.1 % 솔루션입니다. 관의 뚜껑에 좁은 구멍을 만들어 뚜껑의 구멍을 통해 micropipette의 무딘 끝을 삽입합니다. DiI은 적어도 5 분의 필라멘트를 승천 할 수 있습니다. (에탄올의 증발을 방지하기 위해 micropipette를 작성하지 않을 때 항상 뚜껑의 구멍을 커버).
장비 뉴런 염료 주입 (그림 3) 필요합니다.
현미경. 고정 무대 현미경은 초점을 맞추고 동안 배의 수직 이동을 방지하기 위해 신경 염료 주입에 사용되어야합니다. 이 배아와 접촉 한 후 이러한 움직임은 피펫을 치환합니다. 우리는 Zeiss Axioskop FS와 올림푸스 AX50/BX50 고정 단계 모델을 모두가 잘 이러한 목적에 적합 할 것으로 나타났습니다. 현미경은 neur의 시각화를위한 전송 빛 DIC 광학가 장착되어야한다착색하기 전에 기능. 현미경은 오히려 역 모델보다 수직이어야합니다. 역 현미경으로 두 배의 반대편에있는 반면, 수직 현미경으로 micropipette의 끝은보고 목적으로 배아의 같은 편에 있습니다. 후자의 배열은 DIC 광학의 품질을 떨어 뜨리고. 현미경은 DiI 관측에 적합한 필터 세트, 형광 현미경에 설정해야합니다. DiI이 범위의 많은 필터 세트 작동 549 및 565 nm의에서 흥분과 방출 맥시멈있는 comparably 폭 넓은 스펙트럼을 가지고 있기 때문에, 알렉사 568, Cy3, Rhodamine, 텍사스 레드 또는 TRITC에 대한 해당 항목을 지정할 수있다. 이 현미경으로 손 접촉없이 셔터의 작동을 허용하려면 형광 광원의 경로에서 전자 제어 셔터를 맞게 편리하지만, 우리는 또한 효과적으로 만 수동으로 셔터가 장착 된 설정에 표시. 마지막으로, 높은 배율, 높은 수치 apertu다시 물 침적 목적은 분사 동안 관찰이 필요합니다. 이 목표는 coverslip없이 사용하도록 설계해야합니다. 우리는 성공적으로 Zeiss Achroplan 100x/1.0W, 올림푸스 LUMPlan FL 100x/1.0W, 그리고 올림푸스 LUMPlan FL / IR 60x/0.9 W 목표를 사용했습니다.
micromanipulator은 신경 염료 분사 동안 micropipette을 배치하고 이동이 필요합니다. 우리는 Leica의 micromanipulator과 무대 마운트 Narashige 3 축 유압 micromanipulator를 모두 사용했습니다.
현재 분사에 대한 시설과 세포 DC 증폭기는, micropipette에서 DiI의 iontophoretic 주입이 필요합니다.
4. 염료 주입 절차
- 주입 현미경 (그림 3)의 무대에 탑재 된 배아 (들)과 슬라이드를 놓습니다. 배아를 찾아 시야의 중심으로 가져가 10 배 목표를 사용하십시오.
- SW보는 위치로 높은 전력 목표를 들죠과 집중으로 배아를 가져. DIC 광학 (또는 대상 셀 GFP를 표현하는 경우 형광을 사용하여)에서 관심있는 셀을 찾아 시야의 중심으로 가져 가십시오. 현미경의 필드 다이어프램이없는 이상, 단지 시야의 가장자리로 열린되어 있는지 확인하십시오. 좁은 조명 빔 (아래 단계 4.4 참조) micropipette의 위치를 도움이됩니다. 여전히 벨소리 / PBS 용액과 접촉에 남아있는 동안은 배 위에서 가능한 한 높은 때까지 목표를 높입니다.
- 배아와 micropipette의 경로 잘 명확 PBS에 DC 앰프의 목욕 전극을 배치합니다.
- 0.1 M LiCl 용액으로 가득했습니다의 소유자로 사출 micropipette를 삽입합니다. micromanipulator에 micropipette 홀더를 연결합니다. micromanipulator 거친 컨트롤을 사용하여 객관적이고 배의 끝 사이의 공간에 micropipette를 가져.일이 잘 배의 수준 위에 있는지 확인합니다. 때문에 높은 전력 목적의 짧은 작동 거리의, micropipette는 (그림 3 참조) 초점으로 가져옵니다하기 위해 얕은 각도에서 개최해야합니다. 당신은 시행 첫 번째 인스턴스의 오류로 적절한 각도를 설정해야합니다. 각도가 너무 가파른 경우, 당신은 초점에 micropipette 팁을 얻을 수 없습니다. 너무 얕은 경우, micropipette 축이 곳에서 목욕 솔루션을 가지고있는 댐의 벽 파울합니다.
- 센터보기의 분야에서 micropipette의 끝. 이를 위해 배의 수준에 눈을 가져다 현미경 단계의 Y-축에 앞뒤로 micropipette 이동합니다. 그 끝이 빛 경로를 교차 할 때, 당신의 빛 빛의 밝은 반사를 볼 수 있습니다. 빛 광선을 overshoots 있도록 X-축에 앞으로 micropipette의 끝을 이동합니다. 그것은 작은에 micropipette를 찾습니다 쉽게 될 것입니다당신이 그 축보다는 팁을 받으려고하는 경우 높은 전력 목적의 시야. 이제 현미경 접안 렌즈를 통해보고 micropipette의 샤프트가 초점으로 올 때까지 점차적으로 높은 전력 목표를 낮 춥니 다. 이 점차적으로 초점을 접어 듭니다 micromanipulator 컨트롤과 함께 Y-축에 앞뒤로 micropipette를 이동하면, 그것을 찾을 수 있습니다. 그 끝은 시야의 중심에 자리 잡고 때까지 샤프트 초점이되면, X-축에 micropipette 이동합니다. 이 단계에서 micropipette 팁이 잘 배의 수준 이상이어야합니다. 형광 조명으로 전환하고 DiI의 누설을 확인하기 위해 팁을 확인합니다. 끝에서 형성에서 어떤 DiI 크리스탈을 방지하기 위해 DC 전류를 조정합니다.
- micromanipulator 컨트롤 사용하여 Z-축에 micropipette을 낮 춥니 다. 현미경 초점 제어 초점으로 다시 가져와. 점차적으로 이러한 방식으로 배아으로 micropipette을 낮 춥니 다. 처음에는, 당신은 조립과이 작업을 수행 할 수 있습니다micromanipulator와 현미경의 Z-축 제어합니다. 배 초점이 접어 듭니다 그러나 미세 제어 단자로 전환해야합니다.
- 배의 표면이 초점으로되면, micromanipulator의 방향에 시야의 가장자리를 향해 micropipette의 끝으로 이동합니다. 주입 할 셀에 집중하고 시야의 중심에 자리 잡고 있는지 확인합니다. micropipette 팁에 촛점을 다시 맞춰하고 셀로 Y 축에 동일한 수준에 위치해까지 Y 축에 이동합니다. 당신은 Z-축에 낮출으로 X 축에있는 셀을 향해 micropipette의 끝을 이동합니다. Leica의 micromanipulator를 사용하는 경우, 당신은 아마 현미경 단계는 끝이 세포 가까이에지고 있으므로 단 제어로 전환 너에게 micromanipulator 컨트롤보다 X-축에서 운동의 미세한 제어 기능을 제공 제어 것을 알게됩니다.
- 셀과의 접촉에 micropipette 팁을 준비하고 표면에 우울증을합니다. depolarizi 여러 nanoamps을 전달몇 초 동안 NG 현재. 당신은 셀을 형성 DiI의 작은 크리스탈이 표시됩니다. 셀이 표시되었는지 확인하려면 간단히 형광 빛으로 배아를 조명하기 위해 셔터를 연 다음 DIC로 다시 전환합니다. 관심 셀의 몸은 라벨의 흔적을 표시되면 몇 초 이상에 대한 현재 적용됩니다. 현재를 끄고 빠르게 현미경 단계 제어를 사용하여 X-축에 micropipette에서 떨어져 배아를 당긴다. 그런 다음 솔루션에서 micropipette를 철회 할 수 있습니다. 더 DiI 라벨이 분명하지 않을 경우, micropipette가 차단 될 수 있으며 새로운 micropipette으로 교체가 필요합니다. 당신은 micropipette의 끝 관심의 세포로가는 도중에 다른 조직을 낚아하고이 조직이 아닌 세포보다 물들어있는 것을 알 수 있습니다. 이 경우, 약간 micropipette을 인출 시도하고, 셀을 다시 접근한다. 이 micropipette를 교체하고 다시 시도해야 할 수도 있습니다.
- 원하는 경우 여러 셀 individu 할 수 있습니다같은 배아에 표시 앨리.
- 주입 챔버에서 솔루션의 대부분을 제거하고 PBS 4 세차에 이어 10 분에 7.4 %의 포름 알데히드 / PBS를 추가하여 배아를 해결할 수 있습니다. 배아는 다음 DiI이 neuronal 프로세스에 걸쳐 확산 할 수 있도록 (표백 또는 드라이 떨어지는 것을 방지하기 위해) 어두운, 습기 챔버에 최소 4 시간 (또는 하루 아침에 4 ° C에서) 동안 실온에서 남아 있습니다. 이 단계에서, DiI 라벨이 표시된 셀은 하나 photoconverted 할 수 있습니다 또는 공 촛점 현미경에서 직접 볼.
5. DIC 광학을 사용하여 시험을위한 Photoconversion
photoconversion의 원칙은 적절한 파장과 조명 동안 스테인드 세포에 의해 방출 형광 빛으로 DAB의 (사진) 산화입니다. 이 밝은 세포가 약하게 스테인드 세포에 비해 짧은 시간에 photoconverted을 뜻합니다. 한 표본에 라벨이 여러 셀이 밝기에 대한 너무 많은 차이가있는 경우이 difficu 될 수 있습니다동일한 품질에 모두 photoconverting의 lties (그림 4C 참조) :이 경우에 하나가 약한 세포를 (짧은 조명을 사용하여) 무시 또는 밝은 세포 (이상 조명을 사용) 팽창하기 시작하는 수락 사이의 타협을 결정해야 할 수도 있습니다하는 것은 . 모든 셀이 너무 약하게 (따라서 매우 긴 조명을 필요로) 표시하는 경우, 내생 peroxidases으로 인한 배경은 문제가 될 수 있습니다. DAB는 독성이기 때문에 잘 처리해서 다루어 져야합니다. 폐기물은 표백 7 % 염소와 '해제'할 수 있습니다.
- Photoconversion는 개별적으로 각각의 배아에 대해 수행해야합니다. 하나의 배아는 슬라이드 당 주입되는 경우에는 배아를 덮고있는 PBS 솔루션은 DAB 솔루션 (3 MG DAB / ML 트리스 버퍼), 형광 현미경과 100x 목적으로 볼 채워진 셀에 배치 슬라이드로 대체됩니다. (DAB 솔루션에 수직 현미경에게 목표 딥을 사용하고 photoconversion 직후에 물을 여러 번 세척해야합니다rocedure가 완료되며 역 현미경을 사용하는 경우)을 방지 할 수 있습니다. Cy3 필터 세트 100W HG 램프를 사용하고 갈색 DAB 반응 제품까지 붉은 여기 파장에 노출 셀 (시야 조명으로 전환하여 주기적으로 확인)이라는 신경 세포의 증거가됩니다 수 있습니다. 최적의 DAB의 착색을 위해 촬영 시간은 변수이지만, 형광가 완전히 사라졌고 무대 이외의 여기 광에 노출이 필요합니다. photoconversion가 완료되면, PBS와 함께 준비를 여러 번 씻는다. 70 % 글리세롤의 드롭으로 PBS를 교체, 메스 블레이드 실리콘을 멀리 다쳤고, 바세린의 링과 교체하고 coverslip을 추가합니다.
- 여러 배아는 하나의 슬라이드에 가득 된 경우, 유리를 향해 배의 복부 측면과 별도의 24 X 60mm의 coverslip에 PBS의 작은 방울 각 배아를 전송합니다. 우물을 만들고 P와 함께 준비를 충당하기 위해 각 배아 주위에 접착 테이프의 프레임을 삽입합니다BS. 아웃 건조에서 그들을 방지하기 위해 photoconversion 전에 습기 챔버에 슬라이드를 유지. 교환 PBS는 DAB 솔루션으로 배아를 커버. 즉시 100W HG 램프가 장착 역 현미경에 슬라이드를 넣고 도끼 50 목표를 사용하여 DiI을 자극하도록 설정 Cy3 필터를 사용합니다. photoconversion 후, 70 % 글리세롤 한 방울의 신선한 슬라이드에 배아를 전송 매니큐어와 coverslip과 인감을 추가 할 수 있습니다.
6. 공 촛점 현미경에 의한 시험
- 새로운 24 X 60mm의 coverslip에 PBS의 작은 방울 단계 4.10 후, 전송 배아. 우리는 coverslip에 대한 등쪽면 (coverslip과 배아 간의 PBS 만 작은 금액을 떠나는)으로 평평하게 배아를 장착하여 최적의 광학를 얻을 수 있습니다.
- 배 주변에 접착 테이프의 프레임을 놓고 슬라이드로 가득 할 때 프레임을 채우기 위해 PBS 드롭을 확대. 조심스럽게 그 위에 슬라이드를 놓고 매니큐어로 해결할 수 있습니다. 채워진 뉴런은 시험해야공 촛점 (또는 형광) 현미경 가능한 한 빨리에 ined.
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Representative Results
그림 4는 기술의 전형적인 결과를 보여줍니다, 우리는 여기에 대해 설명합니다. 그림 4A 확실히 해두 고 photoconverted 된 DiI 가득 단일 interneuron의 예를 보여줍니다. 그것은 멋지게 세부의 양이 준비 제공을 보여줍니다. 비 라벨 주변 조직 내에있는 레이블 셀의 공간적 맥락이 표시되고 DIC 광학에서 볼 때, 피질 내의 neuropile 내의 섬유 투영의 전지 본체의 위치를 지정할 수있다.
그림 4B는 염료 드롭가 동시에 표시되고 여러 이웃 셀의 결과로 약간 너무 커서 경우가 있습니다. 이는 종종 어려운 고유 한 세포 기관에 개별 계획에 관련 할 수 있습니다. 또한 직접 형광 현미경으로 볼 때 (NO photoconversion) 배경 해상도가 훨씬 낮은 것을 보여줍니다.
그림 4C의 표본
그림 4D는 공 촛점 현미경으로 관찰이 자세히 표시된 세포의 형태를 표시합니다 보여줍니다. DiI 라벨은 GFP의 기자 구조를 탑재 변형율에서 수행되었다. 이 특정 인구 내에서 염료 가득 세포의 공간적 맥락에 대한 중요한 정보를 (그리고 정체성)를 제공 할 수 있습니다 neuronal 또는 GLial 세포 유형 (같은 유전자 발현에 의해 정의).
확인 뉴런의 형태학의 다양성을 평가하는 패러다임으로 우리는 무시의 긍정적 인 뉴런 14 중 하나를 선택했습니다. 이 뉴런은 다른 무시의 긍정적 인 뉴런에서 별도의 neuropile에 등쪽과 중간 위치 가까이 (DAP, 그림 5A, Lundgren 외., 1995)에 위치해 있으며, 따라서 apGal4 - UASGFP 동물에서 쉽게 식별 할 수 있습니다.도 5B는 DAP 세포를 보여줍니다 그는 DiI와 photoconverted로 가득했다. 전지 본체는 앞 접합면의 수준에 위치해 있으며, 처음 중간 선을 향해 성장하고 중간 결합 영역에서 앞집니다 축삭을 보여줍니다. 이 팁에서 swellings 및 전환점이 같은 성장 콘이 있습니다. 이미지 스택에서 최대 추정치로 그린이 셀, 19 라벨은 그림 5C에 요약되어 있습니다. 세포 형태학 좋은 세부가 표시됩니다. 불과 몇 전지는 같은 성장 콘을 표시 구조, 여섯 19 세포의 또한 앞 지점보다 항상 더 짧은 잘 과도 기능 할 수있는 지점 뒤쪽을 보내주십시오. 그림 5D에 표시된 모든 19 DAP 세포는 각 세포는 12 %의 만 불투명도를 갖는으로 정렬됩니다. 더 셀 어두운 것 지역에있는이 결과를 공유 할 수 있습니다. 전지 본체는 중앙 위치 주변에 하나 이상의 셀 직경을 다양하지만, neuropile 내의 축삭의 mediolateral 위치는 훨씬 다양 - neuropile 폭은 (는) 안쪽 두 위치 중 하나에 항상 상주 아홉 부분으로 나누어 져 있습니다 때.
1 그림. 신경 라벨 방법의 단계와 두개의 변종의 개략적 인 개요.
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그림 2. 변형 B.에 따르면, 신경 세포 염색 주입에 대한 Drosophila의 배아를 준비의 다양한 단계를 설명하는 다이어그램은 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. . 염료 분사에 대한 설정의 개략도 오른쪽 삽입은 표본, 분사 micropipette 및 목욕 전극의 배열의 확대입니다 A :. Micromanipulator, B : 고정 무대 현미경. micromanipulator은 얕은 각도로 설정되어 있습니다 - 약 10 & 드. g, C : micropipette, D와 Micropipette 홀더 : plasticine, F로 고정 목욕탕 전극 : 슬라이드, E의 표본 DC 앰프에 연결.
그림 4. 단계 17 배아를의 복부 신경 코드를 DiI - 분류 interneurons의 예. 전망 발등, 앞 왼쪽입니다. 중간 선 : 점선.
- 눈에 잘 띄는 contralateral axonal 투영 및 ipsilateral 수지상 섬유 (화살촉)를 보여주는 완벽하게 photoconverted 단일 셀의 예라고 할 수 있습니다. DIC 광학.
- 하나 이상의 셀이 표시 된에 준비를 보여줍니다 -이은 프로젝션에 하나의 전지 본체의 맑은 과제를 흐릿하게 할 수 있습니다.
- 8 셀은 연속 3 세그먼트에 라벨을 표시했습니다. 또한이 준비 photoconversion는 랜드 마크와 같은 Fas2에 대한 표준 프로토콜 항체 염색법에 이어되었다.
- GFP 기자가 구축 들고 플라이 변형에 공 촛점 현미경을 설명하는 하나의 DiI이 가득한 신경을 보여줍니다.
그림 5. 대상 DiI 라벨은 (GFP 표현에 의해 표시) 확인 뉴런 (14)의 형태학의 다양성의 범위를 보여준다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
- DAP 셀은 (인위적으로 색이 파란색) unambiguously 복부의 무시의 Gal4-UASGFP 패턴 (DAP, 그림 5A, Lundgren 동부 표준시에서 인식 할 수리터. 1995). GFP 표현 세포는 안티 - GFP 항체 물들되었습니다. 중간 선이 점선으로 표시됩니다. AC = 앞 접합면, PC = 뒤쪽 접합면.
- photoconverted DiI이 가득한 DAP 셀의 예를 보여줍니다. 셀은 GFP 자사의 표현에 의해 무시의 Gal4-UASGFP 배아를 입력 염색하기 전에 확인되었다.
- 19 갤러리 이미지 스택에서 최대 추정치로 그린이 세포의 웁니다. 등쪽 전망을 즐기실 수 있습니다. 앞이 다. neuropile는 밝은 회색에, 피질 영역은 어두운 회색에 있습니다.
- 19 DAP 셀은 12 %의 투명도를 갖는 각 셀에 정렬됩니다. 세포의 대부분이 차지하는 영역은 회색의 어두운 그늘이 있습니다. 모든 표본의 neuropile은 (파란색)과 비슷한 너비로 확장되었다하고 중복 있도록 셀 옆에있는 앞 commissures이 정렬되었습니다. 전지 본체는 중심 위치 주위에 하나 이상의 셀 직경을 다양하지만, neuropile 내의 축삭의 mediolateral 위치 표시적은 변화.
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Discussion
모델 시스템으로 Drosophila 중 하나 큰 장점은 단일 세포 수준의 개발과 기능의 분석을 허용한다는 것입니다. 이 세포 유형의 다양성이 매우 높은이며, 이웃 세포의 기능과 형태가 완전히 다를 수 신경계에 관한 특히 유용합니다.
우리가 여기서 제시하는 방법 중 하나 영구적 인 얼룩이나 형광 현미경에 의해 직접 검사로 변환 할 수있는 염료 개별 뉴런의 라벨 수 있습니다. 은 훌륭한 상세 신경 프로세스 (그림 4)의 형태를 보여준다. . 배아 뇌를, Kunz 동부 표준시를 참조하십시오, 방법의 주요 장점 중 하나는 (배아 복부 신경 코드에 대해 Rickert 외를 볼 2011 년이 조사 할 CNS의 뉴런의 거의 모든 유형의 형태와 수 있다는 것입니다 알., 2012). 또한,의 복잡한 조합을 필요로하지 않습니다유전 요소가 어떻게 유전자 분류 기술의 여러 바와 같이, 배아에 존재합니다. 염료 주사는이를 개별 셀 morphologies 야생 유형 또는 돌연변이 배경을 하나의 특정 유전자 발현 패턴 (그림 4D 및 5)의 맥락에서 보여 질 수 있도록, 기자 구조를 운반 동물의 셀에 수행 할 수 있습니다. 우리는 또한 배아 뉴런 11, 12, 거실에서 축삭의 가지의 역학을 모니터링 할 기술을 사용해 왔습니다.
방법은 쉽게 배아를 제공하는 다른 생물의 배아에서 개별 뉴런을 라벨을 적용 할 수는 DIC 조명에 따라 검토 될만큼 투명합니다. 우리는 메뚜기 18 centipedes 17, 갑각류 19, 벌레 16 등의 arthropod 배아, 다양한에서 신경 형태를 시각화하는 데 사용했습니다.
techni의 주요 단점가야는 기술적 인 문제에 자리 잡고 있습니다. 우리는 방법의 현재 세부 계정이 마스터를에 관심이 연구자 도움이 될 것입니다 믿습니다.
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Disclosures
제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 DFG에서 그리니치 표준시로 보조금에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DAB |  Sigma-Aldrich |
D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
| DiI | Invitrogen/Molecular Probes |
D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
| Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
| Glycerol | Roth |
3783 | 70% in PBS |
| Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
| PBS | 1x | ||
| TRIS | Roth |
4855 | |
| Vectashield | Vector Laboratories |
H1000 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
| DC - amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
| Coverslips | Menzel |
BB018018A1 | 18 x 18 mm |
| Coverslips | Menzel |
BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
| Flat Capillaries | Hilgenberg |
outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
| Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
| Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
| Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
| Object Slides | Marienfeld Superior |
1000000 | |
| Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
| Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
| Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1. |
|||
References
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