의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em&gt; Drosophila melanogaster</em

요약

우리는 중추 신경 시스템에 하나의 뉴런을 라벨에 대한 기술 (CNS)의 제시 Drosophila 전송 빛 또는 공 촛점 현미경에 의해 neuronal 형태의 분석을 허용 배아.

초록

이 글에서 우리는 개별적으로 lipophilic 형광 막 마커 DiI의 juxtacellular 주입에 의한 Drosophila melanogaster의 배아 CNS의 뉴런에 레이블을하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 아주 자세히 neuronal 세포 형태의 시각화 할 수 있습니다. 그것은 CNS에있는 셀에 레이블을 할 수 있습니다 : 대상 뉴런의 세포 기관은 DIC 광학에서 또는 GFP 등의 형광 유전자 마커의 표현으로 시각화 수 있습니다. 라벨 후, DiI는 전송 빛과 DIC 광학으로 세포 형태의 시각화를 허용하도록 photoconversion하여 영구적 인 갈색 얼룩로 변환 할 수 있습니다. 또는 DiI - 라벨 세포는 유전자 도입 형광 기자 단백질이 colocalised 할 수 있도록, 공 촛점 현미경과 직접 관찰 할 수 있습니다. 기술은이 가능 단세포 해상도 돌연변이 phenotypes을 분석하고, 관계없이 유전자형의 모든 동물에서 사용할 수 있습니다.

서론

개별 셀의 수준에서 neuronal 형태의 지식은 neuronal 연결 및 CNS 기능을 이해하는 중요한 전제 조건이다. 따라서, 신경 과학의 초기에서, 연구자는 단일 셀 라벨 기술 (이 문제의 역사적인 치료 ⁷ 참조) 개발을 모색하고있다. 이러한 Golgi의 착색 등의 고전 방법은 neuronal 형태의 우수한 해상도를 제공하지만, 하나는 착색이 임의의 방식으로 발생 등의 이동 방법으로 신경 세포의 특정 유형의 라벨을 추구하는 경우 적합하지 않습니다. microelectrode에서 염료의 세포 또는 juxtacellular 주입하여 단일 세포를 얼룩위한 방법의 개발은 특정 상표의 요구 사항을 해결.

Drosophila에 하나의 뉴런 염료 주입의 응용 프로그램 때문에 유기체와 뉴런 모두의 작은 크기, 큰 도전을 제시. 배아 Drosophila의 그럼에도 불구하고, 단일 신경 세포의 착색 뉴런은 코리 굿맨 ^(15)의 연구실에서 1980 년대 중반에 달성되었다. 방법은 eminently 유용하고 지난 20~30년 (예 : ^{2, 10)} 이상 Drosophila의 neuronal 개발을위한 메커니즘으로 몇 가지 주....

프로토콜

우리는 우리의 실험실에서 단일 신경 세포의 라벨 방식의 두 약간 다른 변종을 사용했습니다. 차이는 배아의 수집, dechorionisation, devitellinisation 및 배아 시체를 저민 단계에 관한 것이다. 그림 1은 변종의 공동와 발산 단계에 대한 개요를 제공합니다.

1. 염료 주입을위한 배아 해부 및 Micropipettes를위한 마이크로 바늘의 작성

1. 배아 해부 용 유리 바늘은 셔터 풀러 (과학 계측기) 또는 유사한 장비로 유리 모세관 (1 밀리미터 직경 0.1 mm 벽 두께)에서 차출됩니다. 또한, 바늘 홀더에 장착 electrolytically 날카롭게 0.15 mm의 텅스텐 와이어는 dissections에 사용됩니다. (선명하게 전해 대한 지침은 ⁹ 주어집니다).
2. 셔터 풀러 (과학으로, 염료 사출 micropipettes은 내부 필라멘트 (GB 100 TF 8P 과학 제품)과 얇은 벽 유리 모세 혈관에서 차출됩니다계측기) 또는 유사한 장비. micropipette 팁은 배의 조직 통과를 돕기위한 칼의 점진적이고 균일 한 테이퍼과 날카로운 있어야합니다. 원하는 micropipette는 셔터 악기 피펫 요리 책 설명서 (의 p.20에 ....

결과

그림 4는 기술의 전형적인 결과를 보여줍니다, 우리는 여기에 대해 설명합니다. 그림 4A 확실히 해두 고 photoconverted 된 DiI 가득 단일 interneuron의 예를 보여줍니다. 그것은 멋지게 세부의 양이 준비 제공을 보여줍니다. 비 라벨 주변 조직 내에있는 레이블 셀의 공간적 맥락이 표시되고 DIC 광학에서 볼 때, 피질 내의 neuropile 내의 섬유 투영의 전지 본체의 위치를 지정할 수있다.

그림 4B는 염료 드롭가 동시에 표시되고 여러 이웃 셀의 결과로 약간 너무 커서 경우가 있습니다. 이는 종종 어려운 고유 한 세포 기관에 개별 계획에 관련 할 수 있습니다. 또한 직접 형광 현미경으로 볼 때 (NO photoconversion) 배경 해상도가 훨씬 낮은 것을 보여줍니다.

그림 4.......

토론

모델 시스템으로 Drosophila 중 하나 큰 장점은 단일 세포 수준의 개발과 기능의 분석을 허용한다는 것입니다. 이 세포 유형의 다양성이 매우 높은이며, 이웃 세포의 기능과 형태가 완전히 다를 수 신경계에 관한 특히 유용합니다.

우리가 여기서 제시하는 방법 중 하나 영구적 인 얼룩이나 형광 현미경에 의해 직접 검사로 변환 할 수있는 염료 개별 뉴런의 라벨 수 있습니다. 은 훌륭한 상세 신경 프로세스 (그림 4)의 형태를 보여준다. . 배아 뇌를, Kunz 동부 표준시를 참조하십시오, 방법의 주요 장점 중 하나는 (배아 복부 신경 코드에 대해 Rickert 외를 볼 2011 년이 조사 할 CNS의 뉴런의 거의 모든 유형의 형태와 수 있다는 것입니다 알., 2012). 또한,의 복잡한 조합을 필요로하지 않습니다유전 요소가 어떻게 유전자 분류 기술의 여러 바와 같이, .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약 / 재료의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
			시약
DAB	시그마 - 알드리치	D-5905	100 MM 트리스 - HCL, pH를 7.4에 2-3 MG / ML
DiI	Invitrogen / 분자 프로브	D-282	에탄올 1 MG / ML
포름 알데히드	머크 Millipore		PBS에서 7,4 %
글리세린	로스	3783	PBS의 70%
헵탄 접착제	바이어스 도르프 AG	첼로 31-39-30 *	CA를 희석. N-헵탄과 1-1
PBS			1X
트리스	로스	4855
Vectashield	벡터 연구소	H1000
			장비
공 촛점 현미경	Leica	TCS SP2	형광에 labelings을 확인하고 문서화하는
DC -mplifier	Dragan 공사	초석 ION-100	labelings를 수행하는 방법
Coverslips	Menzel	BB018018A1	18 X 18mm
Coverslips	Menzel	BB024060A1	24 X 60mm
현미경을 해부	Leica	MZ8	배아를 준비하고 disect하기
플랫 모세 혈관	Hilgenberg		외경 1mm, glas 두께 0.1 mm
사출 모세 혈관	과학 제품	기가바이트 100 TF 8P
Micromanipulator의 R	Leica		labelings를 수행하는 방법
모델 P-97	셔터 악기		모세 혈관을 해낼 수 있다는 것을
개체 슬라이드	Marienfeld 수 페리 어	1000000
과학 현미경	Zeiss	Axioskop이 운수성	photoconversion 후 labelings를 볼 수 있습니다
과학 현미경	하늘	BX50	labelings를 수행하는 방법
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