Merking av enkeltceller i Central Nervous System av<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

Vi presenterer en teknikk for merking enslige nevroner i sentralnervesystemet (CNS) av<em> Drosophila</em> Embryoer, som tillater analyse av neuronal morfologi ved enten overført lys eller konfokal mikroskopi.

Abstract

I denne artikkelen beskriver vi hvordan du individuelt merke nevroner i de embryonale CNS av Drosophila melanogaster etter juxtacellular injeksjon av lipofile fluorescerende membran markør DII. Denne metoden gjør det mulig visualisering av neuronal celle morfologi i stor detalj. Det er mulig å merke en celle i CNS: celle organer av target nevroner er visualisert henhold DIC optikk eller ved ekspresjon av et fluorescerende genmarkør eksempel GFP. Etter merking kan DII bli omdannet til en permanent brun flekk ved photoconversion å tillate visualisering av cellemorfologi med overført lys og DIC optikk. Alternativt kan Dii-merkede celler observeres direkte med konfokalmikroskopi, slik genetisk innført fluorescerende reporter proteiner for å bli colocalised. Teknikken kan brukes i noe dyr, uavhengig av genotype, som gjør det mulig å analysere mutant fenotyper ved enkelt celle oppløsning.

Introduction

Kjennskap neuronal morfologi på nivået av individuelle celler er en viktig forutsetning for å forstå neuronal tilkobling og CNS-funksjonen. Derfor, fra de tidligste dagene av nevrovitenskap, har forskerne forsøkt å utvikle enkelt celle merking teknikker (se ⁷ for en historisk behandling av denne saken). Klassiske metoder som Golgi farging gir utmerket oppløsning av neuronal morfologi, men er ikke egnet hvis man søker å merke en spesiell type nervecelle i en rettet måte, som farging oppstår i en tilfeldig måte. Utvikling av metoder for farging enkeltceller ved intracellulær eller juxtacellular injeksjon av fargestoffer fra en microelectrode adressert kravet om spesifikk merking.

Anvendelsen av enkelt Nevron fargestoff injeksjon til Drosophila presentert en stor utfordring, på grunn av den lille størrelsen av både organismen og dens neuroner. Likevel, enkelt Nevron farging av embryonale Drosophila </em> Nevroner ble oppnådd i midten av 1980-tallet i laboratoriet av Corey Goodman ^15. Mens metoden har vært utpreget nyttig og har gitt noen viktige innsikter i mekanismene for neuronal utvikling i Drosophila over de siste 20-30 år ^{(2 f.eks, 10),} har mange arbeidstakere skvatt unna det, hovedsakelig på grunn av sine tekniske krav.

Tilgjengeligheten i de senere år av genetiske teknikker for neuronal merking i Drosophila har også bidratt til upopularitet av enkelt Nevron fargestoff injeksjon. GAL4-regissert uttrykk for membran målrettede GFP konstruerer kan gi god oppløsning av nevrale morfologi ^{1, 20.} Imidlertid har denne metoden visse begrensninger: den ofte uunngåelig uttrykk for GFP i flere celler kan skjule strukturen i enkelte nerveceller og en GAL4 driver linje kan ikke være tilgjengelig for å kjøre uttrykk i en bestemt nevron av interesse. Den MARCM (Mosaic Analyse med Repressible Cell Marker) metode ⁸ kan gi merking av hovedsak enhver Nevron på individ cellenivå, men kan ikke med hell brukes i embryo og tidlig larven grunn av treg omsetningen av GAL80 proteinet.

Gitt disse begrensningene av genetisk merking, tror vi at enkelt Nevron fargestoff injeksjon i Drosophila embryo forblir en verdifull teknikk og fortjener bredere anvendelse. Å fremme dette målet, gir vi her en detaljert beskrivelse av metoden. En illustrasjon av sin makt er gitt av vår siste redegjørelse for morfologi av komplett sett av interneurons i abdominal neuromeres på slutten Drosophila embryo ^14. Denne studien, som viste både morfologiske variasjon av individuelle nevrale celletyper og prinsippene for neuromere organisasjon i CNS av embryoet, ville ikke vært mulig med noen annen tiden tilgjengelig merking metoden.

Protocol

Vi har brukt to litt forskjellige varianter av enkelt Nevron merking Fremgangsmåte i våre laboratorier. Forskjellene er knyttet til fosteret samling, dechorionisation, devitellinisation og embryo filetering skritt. Figur 1 gir en oversikt over de vanligste og divergerende trinn variantene. 1. Utarbeidelse av Micro-nåler for Embryo Dissection og Mikropipetter for Dye Injection Glass nåler for embryo disseksjon er hentet fra glass kapillærer (1 mm diameter og 0…

Representative Results

Figur 4 illustrerer typiske resultater av teknikken, beskriver vi her. Fig. 4A viser et eksempel på en Dii fylt enkelt interneuron som ble ren photoconverted. Det viser pent mengden detaljer disse forberedelsene tilbudet. Sett under DIC optikk den romlige konteksten av den merkede celle innenfor det ikke-merkede omliggende vev blir synlig, f.eks plasseringen av cellen organ innen cortex og av fiber projeksjon innenfor neuropile. Figur 4B</s…

Discussion

En stor fordel med Drosophila som modellsystem er at det tillater analyse av utvikling og funksjon av nivået av enkeltceller. Dette er spesielt nyttig om nervesystemet, hvor mangfoldet av celletyper er eksepsjonelt høy og funksjon og morfologi av nabocellene kan være helt annerledes.

Metoden vi her presenterer tillater merking av individuelle nevroner med et fargestoff som kan enten omdannes til et permanent flekk eller undersøkt direkte ved fluorescens mikroskopi. Det avslører…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
			REAGENTS
DAB	Sigma-Aldrich	D-5905	2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4
DiI	Invitrogen/Molecular Probes	D-282	1 mg/ml in ethanol
Formaldehyde	Merck Millipore		7,4 % in PBS
Glycerol	Roth	3783	70% in PBS
Heptane Glue	Beiersdorf AG	Cello 31-39-30 *	dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane
PBS			1x
TRIS	Roth	4855
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
			EQUIPMENT
Confocal Microscope	Leica	TCS SP2	to view and document labelings in fluorescence
DC – amplifier	Dragan Corporation	Cornerstone ION-100	to perform the labelings
Coverslips	Menzel	BB018018A1	18 x 18 mm
Coverslips	Menzel	BB024060A1	24 x 60 mm
Dissecting Microscope	Leica	MZ8	to prepare and disect embryos
Flat Capillaries	Hilgenberg		outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm
Injection Capillaries	Science Products	GB 100 TF 8P
Micromanipulator R	Leica		to perform the labelings
Model P-97	Sutter Instruments		to pull capillaries
Object Slides	Marienfeld Superior	1000000
Scientific Microscope	Zeiss	Axioskop 2 mot	to view labelings after photoconversion
Scientific Microscope	Olympus	BX50	to perform the labelings
Sony MC3255 Video Camera	Sony/AVT Horn	Sony MC3255	to record labelings after photoconversion

Table 1.