Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

Nous présentons une technique pour l'étiquetage des neurones simples dans le système nerveux central (SNC) de<em> Drosophila</em> Embryons, ce qui permet l'analyse de la morphologie neuronale soit par lumière transmise ou microscopie confocale.

Abstract

Dans cet article, nous décrivons comment étiqueter individuellement les neurones dans le SNC embryonnaire de Drosophila melanogaster par injection juxtacellulaire de la membrane lipophile Dil marqueur fluorescent. Cette méthode permet la visualisation de la morphologie des cellules neuronales dans les moindres détails. Il est possible de marquer n'importe quelle cellule du système nerveux central: les corps cellulaires des neurones cibles sont visualisés sous une optique DIC ou par expression d'un marqueur fluorescent génétique comme la GFP. Après marquage, le DiI peut être transformée en une tache brune permanente par photoconversion pour permettre la visualisation de la morphologie des cellules avec de la lumière transmise et de l'optique DIC. Alternativement, les cellules Dil-marqués peuvent être observés directement par microscopie confocale, permettant génétiquement introduits protéines rapporteurs fluorescents à colocalised. Cette technique peut être utilisée dans n'importe quel animal, quelle que soit le génotype, ce qui permet d'analyser les phénotypes mutants à résolution cellule unique.

Introduction

La connaissance de la morphologie neuronale au niveau des cellules individuelles est une condition essentielle pour la compréhension de la connectivité neuronale et la fonction du système nerveux central. Ainsi, dès les premiers jours de la neuroscience, les chercheurs ont cherché à développer des simples techniques de marquage de cellules (voir ⁷ pour un traitement historique de cette question). Les méthodes classiques comme la coloration de Golgi fournir une excellente résolution de la morphologie neuronale, mais ne sont pas adaptés si l'on cherche à identifier un type particulier de neurone d'une manière dirigée, que la coloration se produit de façon aléatoire. Le développement de méthodes pour la coloration des cellules individuelles par injection intracellulaire ou juxtacellulaire de colorants à partir d'une microélectrode l'exigence en matière d'étiquetage spécifique.

L'application de neurone unique colorant injection chez la drosophile a présenté un défi majeur, en raison de la petite taille de l'organisme et à la fois ses neurones. Néanmoins, la coloration seul neurone de Drosophila embryonnaire </em> Neurones a été atteint au milieu des années 1980 dans le laboratoire de Corey Goodman ^15. Bien que la méthode a été éminemment utile et a fourni des renseignements clés sur les mécanismes de développement neuronal chez la drosophile au cours des 20-30 dernières années (par exemple, ^{2, 10),} de nombreux travailleurs ont renoncé en grande partie à cause de ses exigences techniques.

La disponibilité de ces dernières années des techniques génétiques pour l'étiquetage des neurones chez la drosophile a également contribué à l'impopularité de l'injection de colorant unique neurone. Expression GAL4-dirigé des constructions GFP membrane ciblées peuvent fournir une excellente résolution de la morphologie des neurones ^{1, 20.} Cependant, cette méthode présente certaines limites: l'expression souvent inévitable de la GFP dans les cellules multiples peuvent obscurcir la structure des neurones individuels et une ligne pilote de GAL4 peut ne pas être disponible pour conduire l'expression dans un neurone d'intérêt particulier. Le MarcM (Analyse mosaïque avec un représentantmarqueur des cellules ressible) Méthode ⁸ peut fournir l'étiquetage des neurones essentiellement tout au niveau de la cellule individuelle, mais ne peut pas être utilisé avec succès dans l'embryon et la larve au début à cause de la rotation lente de la protéine GAL80.

Compte tenu de ces limites de l'étiquetage génétique, nous croyons que l'injection de colorant seul neurone dans l'embryon de drosophile reste une technique intéressante et mérite une plus large application. Pour promouvoir cet objectif, nous proposons ici une description détaillée de la méthode. Une illustration de sa puissance est fournie par notre récent compte de la morphologie de l'ensemble des interneurones dans neuromeres abdominale de l'embryon chez la drosophile fin ^14. Cette étude, qui révèle à la fois la variabilité morphologique des différents types de cellules neuronales et les principes d'organisation neuromere dans le SNC de l'embryon, n'aurait pas été possible avec n'importe quelle méthode d'étiquetage actuellement disponible autres.

Protocol

Nous avons utilisé deux variantes légèrement différentes de la méthode de marquage seul neurone dans nos laboratoires. Les différences portent sur ​​la collecte d'embryons, dechorionisation, devitellinisation et les étapes de filetage embryons. Figure 1 donne un aperçu des étapes communs et divergents des variantes. 1. Préparation des micro-aiguilles pour dissection de l'embryon et Micropipettes pour injection Dye Aiguilles de verre pour la d…

Representative Results

La figure 4 illustre les résultats typiques de la technique, que nous décrivons ici. Figure 4A montre un exemple de Dil interneurone unique rempli qui a été proprement photoconverted. Il démontre bien le niveau de détail de ces préparatifs offre. Lorsqu'elle est vue sous une optique DIC le contexte spatial de la cellule marquée dans le tissu environnant non marqué est visible, par exemple, la position du corps de la cellule à l'intérieur de l'écorce et d…

Discussion

Un avantage majeur de la drosophile comme modèle de système est qu'il permet l'analyse du développement et de la fonction au niveau des cellules individuelles. Ceci est particulièrement utile en ce qui concerne le système nerveux, où la diversité des types de cellules est exceptionnellement élevé et la fonction et la morphologie des cellules voisines peut être totalement différente.

Procédé nous présentons ici permet le marquage des neurones individuels avec un…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
			REAGENTS
DAB	Sigma-Aldrich	D-5905	2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4
DiI	Invitrogen/Molecular Probes	D-282	1 mg/ml in ethanol
Formaldehyde	Merck Millipore		7,4 % in PBS
Glycerol	Roth	3783	70% in PBS
Heptane Glue	Beiersdorf AG	Cello 31-39-30 *	dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane
PBS			1x
TRIS	Roth	4855
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
			EQUIPMENT
Confocal Microscope	Leica	TCS SP2	to view and document labelings in fluorescence
DC – amplifier	Dragan Corporation	Cornerstone ION-100	to perform the labelings
Coverslips	Menzel	BB018018A1	18 x 18 mm
Coverslips	Menzel	BB024060A1	24 x 60 mm
Dissecting Microscope	Leica	MZ8	to prepare and disect embryos
Flat Capillaries	Hilgenberg		outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm
Injection Capillaries	Science Products	GB 100 TF 8P
Micromanipulator R	Leica		to perform the labelings
Model P-97	Sutter Instruments		to pull capillaries
Object Slides	Marienfeld Superior	1000000
Scientific Microscope	Zeiss	Axioskop 2 mot	to view labelings after photoconversion
Scientific Microscope	Olympus	BX50	to perform the labelings
Sony MC3255 Video Camera	Sony/AVT Horn	Sony MC3255	to record labelings after photoconversion

Table 1.