EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム
Summary
タンパク質複合体は、重要な細胞機能を触媒する。多くの重要な複合体の詳細な機能と構造解析、組換え生産を必要とします。 MultiBacは、特に真核生物タンパク質及びそれらの複合体を発現するために調整バキュロウイルス/昆虫細胞系である。 MultiBacはオープンアクセスプラットフォーム、およびその有用性を最大化するために開発された標準的な操作手順として実装されました。
Abstract
プロテオミクス研究は、前例のない詳細に真核生物のプロテオームの印象的な複雑さを明らかにした。それは今では、細胞内のタンパク質はほとんど孤立実体としてではなく存在するが、ほとんどすべてではない重要な機能のため、セル内組立ラインを形成し、人間の10以上では、多くの他のタンパク質に関連してその生物学的活性を発揮することが一般的に受け入れられている概念です。1 、これらの多アセンブリの機能とアーキテクチャの2知識は優れた品質と詳細な分析のために十分な量のそれらの提供を必要とします。細胞内の多くのタンパク質複合体の不足は、真核生物において、特に、天然のソースからそれらの抽出を禁止し、組換え生産を必要とする。バキュロウイルス発現ベクター系（BEVS）は真核生物タンパク質を製造するために特に有用であることが証明されて、活性は、多くの場合、翻訳後プロセシングに依存する他の一般的に使用される発現系は、しばしばできることサポートしていない。3 BEVSは、目的の遺伝子が交互に選択したタンパク質を産生昆虫細胞培養物を感染させるために挿入された組換えバキュロウイルスを使用します。 MultiBacは、多くのサブユニットを含有する真核タンパク質複合体の製造に特に調整されているBEVSある。4タンパク質およびそれらの複合体を効率よく製造するための極めて重要な前提条件は、理想的として実装することができる発現実験に関与するすべてのステップのための堅牢なプロトコルである標準作業手順書（SOP）と比較的容易に非専門家ユーザーがまた続く。欧州分子生物学研究所（EMBL）におけるMultiBacプラットフォームは、タンパク質の小規模な分析に異種タンパク質の生産特性のために最適化設計されたバキュロウイルスゲノムに遺伝子を挿入することから開始し、多複雑な式実験に関与するすべてのステップのためのSOPを使用しています生産標本。5-8プラットフォームEMBLグルノーブルでのオープンアクセスモードでインストールされており、タンパク質の複雑な研究プロジェクトを加速するために学界と産業界から多くの科学者を支援してきました。
Introduction
生物学的活性は、タンパク質および細胞機能を触媒するために協調して作用する他の生体分子のアセンブリによって制御される。顕著な例は、メッセンジャーRNAへのDNAに含まれる遺伝情報を転写する機械があります。ヒトでは、100以上のタンパク質であるRNAポリメラーゼIIや、TFIID、TFIIHおよび他のような一般的な転写因子。9その他の例を含む10以上のサブユニットを持つ大規模な多タンパク質複合体を形成し、遺伝子を転写するために定義され、規制のプロセスで一緒に来るリボソーム、タンパク質合成、または真核生物の核膜を介して生体分子を往復する責任が核膜孔複合体を触媒する多くのタンパク質およびRNA分子からなる。セル内の本質的にすべての多成分のマシンの詳細な建築と生化学解剖はその機能を理解することが不可欠です。原核生物とeukarの構造解明yoticリボソーム、例えば、これらの高分子マシンはセルでの指定機能を実行する方法に前例のない洞察力を得て構成特徴的なイベント。10,11
リボソームは、最大細胞の質量の30％にすると、リボソームから構成されるという事実のため、培養細胞から内因性の物質を精製することにより詳細な研究のための十分な質および量を得ることができる。 RNAポリメラーゼIIは、桁違いにすでに少ない豊富で、酵母培養の多くは千リットルは、転写の中心、この本質的な複合体の詳細な原子のビューを取得するために処理されなければならなかった。他の本質的な複合体の12圧倒的多数でしかし存在している天然の細胞において非常に低い量、従って、天然源材料から十分に浄化できない。このような複合体をレンダリングするために詳細にアクセス可能な構造と機能解析、組換えTEを使用して異種の生産を必要とするchniques。
組換えタンパク質の生産は、生命科学研究に大きな影響を与えた。多くのタンパク質は、組換え生産され、それらの構造および機能は、高解像度で解剖した。構造的ゲノミクスプログラムは、ハイスループット（HT）モードで全体の生物の遺伝子産物のレパートリーに対処するための多くの生物のゲノムの解明を利用している。タンパク質構造の数千人は、このように決定されている。現在までに、組換えタンパク質の生産に最も豊富に使用されるシステムは、E.されている大腸菌 、多くの発現系は、このホストにおける異種生産のために長年にわたって開発され洗練されてきた。 E.のタンパク質産生を可能にするために官能基の過多を保持するプラスミド大腸菌は、商用プロバイダの全体のカタログを埋める。
しかし、E.大腸菌は、多くの真核生物タンパク質を産生することが適さない特定の制限があり、およびpで多くのサブユニットを有する関節タンパク質複合体。したがって、真核生物宿主におけるタンパク質生産はますます近年の選択の方法となっています。真核生物タンパク質を生成するために特によく適したシステムは、研究室で栽培昆虫細胞培養物を感染させるために異種遺伝子を担持する組換えバキュロウイルスに依存するバキュロウイルス発現ベクター系（BEVS）である。 MultiBacシステムは、特に、多くのサブユニット（ 図1）真核生物タンパク質複合体の製造に合わせて調整され、より最近開発BEVSある。 MultiBacが最初に2004年に導入された図13は 、その導入以来、MultiBacを連続洗練されており、処理を簡略化する標的タンパク質の品質を向上させ、一般的に効率的な標準業務手順書（SOP）を設計することにより、非専門家のユーザーにシステムがアクセスできるようにするためにストリーム並ぶ。 4 MultiBacは、ACで、世界中の多くの研究室で実施されているademiaや業界。グルノーブルEMBLで、国境を越えたアクセスプログラムは、自分の研究を進めるために、この生産システムを利用することを望んだ科学者のためMultiBacプラットフォームで専門的なトレーニングを提供するために、欧州委員会によって所定の位置に置かれた。これまでアクセスできていなかった多くのタンパク質複合体の構造および機能はMultiBacで生成試料を用いて明らかにした。以下、4彼らはEMBLグルノーブルでMultiBac施設で稼動しているように、MultiBac生産の本質的なステップは、プロトコルにまとめる。
Protocol
Representative Results
Discussion
図2と図3のビデオスナップショットは多重遺伝子発現のcDNAからロボット支援世代から全体のプロセスを説明すると、タンパク質生産のための昆虫細胞培養の感染にすべての方法を構築します。新しい試薬（プラスミドおよびウイルス）と堅牢なプロトコルは、SOPのに頼ってパイプラインを有効にするために開発されてきた。パイプライン全体は、グルノーブルのEMBL?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、クリストフBieniossek、サイモンTrowitzsch、ダニエル·フィッツジェラルド、雄一郎高木、クリスティSchaffitzel、イヴォンヌウンツィケル、ティモシーリッチモンド、ヘルプやアドバイスバーガー研究室のすべての過去と現在のメンバーに感謝。 MultiBacプラットフォームとその開発がされており、寛大にスイス国立科学財団（SNSF）、アジャンスナショナル·デ·ルシェルシュ（ANR）とセンターナショナル·デ·ルシェルシュ科学研究（CNRS）と欧州委員会（EC）を含む、資金提供機関によってサポートされていますフレームワークプログラムで（FP）6と7。国境を越えたアクセスのサポートはEC FP7プロジェクトP-CUBE（によって提供されますwww.p-cube.eu ）とBioStruct-X（ www.biostruct-x.eu ）。科学フランス語省は特にヴェスD'アベニールプロジェクトFRISBIを通してEMBLでMultiBacプラットフォームをサポートするため認められている。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
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