Den MultiBac Protein Complex Production Platform vid EMBL
Summary
Proteinkomplex katalysera viktiga cellfunktioner. Detaljerad funktionell och strukturell karaktärisering av många viktiga komplex kräver rekombinant produktion. MultiBac är ett baculovirus / insektscell-system särskilt anpassat för att uttrycka eukaryota proteiner och deras komplex. MultiBac genomfördes som en öppen tillgång plattform, och standardrutiner som utvecklats för att maximera sin nytta.
Abstract
Proteomik forskning visade imponerande komplexitet eukaryota proteom i oöverträffad detaljrikedom. Det är nu en allmänt accepterad föreställning om att proteiner i cellerna oftast existerar inte som isolerade enheter utan utövar sin biologiska aktivitet tillsammans med många andra proteiner i människan tio eller fler, bildar monteringslinjer i cellen för de flesta om inte alla vitala funktioner. 1 , 2 Kunskap om funktion och arkitektur av dessa Multiproteinkomplex församlingar kräver sin bestämmelse i överlägsen kvalitet och tillräcklig mängd för detaljerad analys. Bristen på många proteinkomplex i cellerna, i synnerhet i eukaryoter, förbjuder deras utvinning från naturliga källor, och kräver rekombinant produktion. The baculovirus expressionsvektorsystem (BEVS) har visat sig vara särskilt användbar för framställning av eukaryota proteiner, förlitar vars aktivitet ofta på posttranslationell bearbetning som andra vanligen använda expressionssystem ofta kaninte stödja. tre BEVS använder ett rekombinant baculovirus i vilken genen av intresse insattes att infektera insekt cellkulturer som i sin tur producerar proteinet av val. MultiBac är en BEVS som har särskilt anpassat för produktion av eukaryota proteinkomplex som innehåller många subenheter. 4 En viktig förutsättning för effektiv produktion av proteiner och deras komplex är robusta protokoll för alla steg som ingår i ett uttryck experiment som helst kan genomföras som standardrutiner (SOP) och följs även av icke-specialiserade användare med jämförande lätthet. Den MultiBac plattform vid European Molecular Biology Laboratory (EMBL) använder standardrutiner för alla steg som ingår i en multiproteinkomplex uttryck experiment, från införandet av gener i en konstruerad bakuloviral genom optimerad för heterologa egenskaper protein produktion till småskalig analys av proteinet exemplar framställda. 5-8 Plattformeninstalleras i ett öppet tillträde läge vid EMBL Grenoble och har stöttat många forskare från akademi och industri att påskynda protein komplexa forskningsprojekt.
Introduction
Biologisk aktivitet styrs av aggregat av proteiner och andra biomolekyler som verkar i samförstånd för att katalysera cellulära funktioner. Noterbara exempel inkluderar det maskineri som transkriberar den ärftliga informationen i DNA till budbärar-RNA. Hos människor, mer än 100 proteiner samlas i en definierad och reglerad process att transkribera gener, bildar stora multiproteinkomplex med 10 och fler subenheter inklusive RNA-polymeras II och de allmänna transkriptionsfaktorer såsom TFIID, TFIIH och andra. 9 Andra exempel är ribosomen, som består av många proteiner och RNA-molekyler, som katalyserar proteinsyntes, eller den nukleära por komplex som är ansvarig för shuttling biomolekyler genom kärnhöljet i eukaryoter. En detaljerad arkitektoniska och biokemisk dissektion av väsentligen alla flerkomponenttextilfibrer maskiner i cellen är viktigt att förstå deras funktion. Strukturen belysning av prokaryota och eukaryotic ribosomer, till exempel, utgjorde kännemärke händelser som ger oöverträffad inblick i hur dessa makromolekylära maskiner utföra sina funktioner i cellen. 10,11
Ribosomer kan erhållas i tillräcklig kvalitet och kvantitet för detaljerad studie genom att rena det endogena material från odlade celler, på grund av det faktum att upp till 30% av den cellulära massan består av ribosomer. RNA-polymeras II är redan mindre rikligt med flera storleksordningar, och många tusen liter av jästkultur måste bearbetas för att få en detaljerad atomär syn på denna viktiga komplex centralt för transkription. 12 Den överväldigande majoriteten av de andra viktiga komplexen är dock närvarande i mycket lägre belopp i nativa celler, och därmed kan inte renas tillräckligt från nativt källmaterialet. Att göra sådana komplex tillgängliga för detaljerad strukturell och funktionell analys kräver heterolog produktion genom att använda rekombinant techniques.
Rekombinant protein produktionen haft en stor inverkan på biovetenskaplig forskning. Många proteiner produceras rekombinant, och deras struktur och funktion dissekerade vid hög upplösning. Structural Genomics program har utnyttjat klargörandet av genomen hos många organismer att ta itu med den repertoar genprodukten av hela organismer i hög genomströmning (HT)-läget. Tusentals proteinstrukturer har sålunda fastställts. Hittills har det mest produktivt använda systemet för rekombinant protein produktion varit E. coli, och många expressionssystem har utvecklats och förfinats genom åren för heterolog produktion i denna värd. De plasmider som härbärgerar en uppsjö av funktioner för att aktivera protein produktion i E. coli fyller hela kataloger av kommersiella leverantörer.
Emellertid E. coli har vissa begränsningar som gör det olämpligt att producera många eukaryota proteiner och partikulära proteinkomplex med många subenheter. Därför har proteinproduktion i eukaryota värdar blivit allt den metod som föredras under senare år. En särskilt väl lämpad för att producera eukaryota proteiner är bakulovirusuttryckningsvektorn systemet (BEVS) som bygger på ett rekombinant baculovirus bär de heterologa gener att infektera insekt cellkulturer odlas i laboratoriet. Den MultiBac-systemet är en mer nyligen utvecklade BEVS som är speciellt anpassade för produktion av eukaryota proteinkomplex med många subenheter (Figur 1). MultiBac först infördes 2004. Sedan introduktionen 13, har MultiBac varit kontinuerligt förfinats och renodlats för att förenkla hantering, förbättra kvaliteten målprotein och allmänt göra systemet tillgängligt för icke-specialiserade användare genom att utforma effektiva standardrutiner (SOP). 4 MultiBac har genomförts i många laboratorier över hela världen, i academia och industri. Vid EMBL i Grenoble, var transnationell tillgång program som införts av Europeiska kommissionen för att ge sakkunnig utbildning vid MultiBac plattform för forskare som ville använda detta produktionssystem för avancera sin forskning. Strukturen och funktionen hos många proteinkomplex som hittills varit inte tillgänglig utreddes med hjälp av prover som produceras med MultiBac. På följande 4, är de viktigaste stegen i MultiBac produktion sammanfattas i protokoll som de är i drift vid MultiBac anläggningen vid EMBL Grenoble.
Protocol
Representative Results
Discussion
Video snap-skott i Figurerna 2 och 3 illustrerar hela processen från robot-assisterad generationen från cDNA av multigenfamilj uttryckskonstruktionerna hela vägen till infektion av kryp cellkulturer för proteinproduktion. Nya reagenser (plasmider och virus) samt robusta protokoll har utvecklats för att möjliggöra en rörledning förlita sig på standardrutiner. Hela ledningen har genomförts som en plattform teknik vid EMBL i Grenoble. Den MultiBac plattformen har visats av mång…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond och alla tidigare och nuvarande medlemmar av Berger laboratorium för hjälp och råd. Den MultiBac plattformen och dess utveckling har varit och är generöst stöd från finansiärer, inklusive den schweiziska National Science Foundation (SNSF), Agence National de Recherche (ANR) och Centrum National de Recherche Scientifique (CNRS) och Europeiska kommissionen (EG) i ramprogrammen (FP) 6 och 7. Stöd till gränsöverskridande tillgång ges av EG FP7-projekt P-CUBE ( www.p-cube.eu ) och BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). Det franska ministeriet för vetenskap är särskilt känd för att stödja MultiBac plattform vid EMBL genom Investissement d'Avenir FRISBI.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
- Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
- Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).
- Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
- Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
- Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
- Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. Atomic structures of the eukaryotic ribosome. Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
- Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
- Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
- Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
- Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, Structure of the mitotic checkpoint complex. Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).
- Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).
