Ex Vivo Blood Red Cell Hemólisis Ensayo para la Evaluación de pH sensibles a agentes endosomolítico para la entrega citosólica de Drogas biomacromoleculares
Summary
Un ensayo de hemólisis se puede utilizar como una rápida, de alto rendimiento pantalla de cytocompatibility sistemas de administración de fármacos y la actividad endosomolítico para entrega de carga intracelular. El ensayo mide la disrupción de membranas de eritrocitos como una función del pH del medio ambiente.
Abstract
Bicapas de fosfolípidos que constituyen endo-lisosomal vesículas pueden suponer un obstáculo para la entrega de medicamentos biológicos a los objetivos intracelulares. Para superar esta barrera, una serie de portadores de fármacos sintéticos han sido diseñados para interrumpir activamente la membrana endosomal y entregar la carga en el citoplasma. Aquí se describe el ensayo de hemólisis, que se puede utilizar como rápido y de alto rendimiento para la pantalla cytocompatibility y actividad endosomolítico intracelulares de sistemas de suministro de fármacos.
En el ensayo de hemólisis, las células rojas de la sangre y los materiales de ensayo se incuban conjuntamente en tampones a pH definidos que imitan extracelulares, endosomal temprano y tardío endo-lisosomales entornos. Tras una etapa de centrifugación para sedimentar glóbulos rojos intactos, la cantidad de hemoglobina liberada en el medio se midió espectrofotométricamente (405 nm para el mejor rango dinámico). El porcentaje de glóbulos rojos interrupción se cuantifica en relación con el control positivo samples lisadas con un detergente. En este sistema de modelo de la membrana de los eritrocitos sirve como un sustituto para la membrana de bicapa lipídica que encierra endo-lisosomales vesículas. El resultado deseado es la hemólisis despreciable a pH fisiológico (7,4) y la hemólisis robusta en el intervalo de pH endo-lisosomal de aproximadamente pH 5-6.8.
Introduction
Aunque hay muchos potenciales de alto impacto dianas terapéuticas dentro de la célula, la administración intracelular de agentes plantea un desafío significativo. Con frecuencia, los fármacos, especialmente biológicos, son internalizados por las células a la trata en vesículas que o bien conducir a la degradación de su contenido a través de la vía endo-lisosomal, o son transportados de nuevo fuera de la célula a través de exocitosis. 1 En el último proceso, el pH interno de las vesículas se acidifica a aproximadamente 5-6, que es el pH óptimo para la actividad de las enzimas que funcionan en este compartimiento, tal como lisozima. 2
Recientemente, una serie de materiales han sido diseñados específicamente para aprovechar la acidificación de los endosomas para facilitar la entrega citosólica de su carga. Un ejemplo de este enfoque utiliza polímeros sintéticos, nanopartículas micelares cuyo núcleo es de ion híbrido y neutro de carga a pH fisiológico (es decir, 7,4). Sin embargo, a pH 6,0- 6,5, los polímeros a ser protonados y adquirir una carga positiva neta que desestabiliza el núcleo de la micela, y los segmentos de polímero expuestos interactuar con y alteran la membrana endosomal. Esta actividad se ha demostrado para promover el escape endosomal de péptidos y ácidos nucleicos basados en ácido terapéutica, lo que les permite acceder a sus objetivos citosólicas. 3,4 Otros ejemplos de métodos desarrollados para mediar de escape endosomal que interrumpir la barrera de la membrana incluyen 'fusogénicos' o péptidos proteínas que pueden mediar la fusión de membranas o la formación de poros transitorios en la bicapa de fosfolípidos. 5 homopolímeros de ácidos acrílicos aniónicos de alquilo tales como poli (ácido propilacrílico) son otro enfoque bien estudiado, y en estos polímeros, el estado de protonación de ácido carboxílico colgantes dicta transición en un hidrófobo, la membrana disruptiva de estado en intervalos de pH endo-lisosomales 6,7.
Un sistema de modelo útil para el cribado de comportamiento endosomolítico es el correox dependiente del pH in vivo ensayo de hemólisis. 8 En este sistema modelo, la membrana de los eritrocitos sirve como un sustituto para la membrana de bicapa lipídica que encierra endo-lisosomales vesículas. Este modelo generalizable ha sido utilizado por otros, para evaluar el comportamiento de endosomolítico penetran en las células péptidos y otros sistemas poliméricos de liberación de genes. 8-11 En este experimento, las células rojas de la sangre y los materiales de ensayo se incuban conjuntamente en tampones a pH definidos que imitan extracelulares (7,4), a principios endosomal (6,8), y tarde endo-lisosomal (<6,8) entornos. La cantidad de hemoglobina liberada durante el período de incubación se cuantificó como una medida de la lisis de glóbulos rojos, que se normaliza a la cantidad de hemoglobina liberada en muestras de control positivas lisadas con un detergente.
A partir de la detección de una pequeña biblioteca de materiales de ensayo potencialmente endosomolítico, se puede inferir que las muestras que no producen hemólisis a un pH de 7,4, pero dobladillo significativamente elevadosolysis a pH <6,5, serán los candidatos más eficaces y citocompatible para administración de fármacos citosólica. Los materiales que se ajusten a estos criterios se espera que permanezca inerte y no indiscriminadamente destruir las membranas de bicapa lipídica (es decir, que podría causar citotoxicidad) hasta ser expuesto a una caída en el pH local después de la internalización en endo-lisosomales compartimentos.
En este protocolo, los eritrocitos se aíslan de un donante humano y co-incubadas a pH 5,6, 6,2, 6,8, o 7,4 con agentes experimentales endosomolítico de suministro de fármacos. Los eritrocitos intactos se sedimentan, y los sobrenadantes (que contiene la hemoglobina liberada a partir de eritrocitos lisados) se analizan para la absorbancia característica de la hemoglobina a través de un lector de placas (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
sensibilidad al pH polímeros u otros agentes diseñados para la función endosomolítico puede ser rápida y eficaz detección basado en la lisis de las células rojas de la sangre a valores de pH encontradas en el endosoma (Figura 1; pH 6,8 – endosoma temprano, pH 6,2 – endosoma tardío, pH 5,6 – lisosoma). 14-17 dependiente del pH hemólisis se ha utilizado para cribar la capacidad de las compañías para mediar en la liberación endosomal de la terapéutica biomacromoleculares (por ej…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen la financiación a través del Departamento de Defensa, el Congreso dirigió programas de Investigación Médica (# W81XWH-10-1-0445), los Institutos Nacionales de Salud (NIH R21 HL110056), y la American Heart Association (# 11SDG4890030).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BD Vacutainer – K2EDTA Vacutainer Tubes | Fisher Scientific | 22-253-145 | For blood collection |
| BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge | Fisher Scientific | 02-665-31 | For blood collection |
| BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter | Fisher Scientific | 22-289-953 | For blood collection |
| BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | For blood collection |
| BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet | Fisher Scientific | 02-657-6 | For blood collection |
| Hydrochloric acid (conc.) | Fisher Scientific | A144-500 | For adjustment of pH of D-PBS. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Positive control |
| Dulbecco’s PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
| BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-2C | For plate-reading at the end of the assay. |
| BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-17 | For incubation of red blood cells with experimental agents. |
References
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2002).
- Boasson, E. H. On the Bacteriolysis by Lysozyme. The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).
- Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery. J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).
- Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic. 7, 468-476 (2010).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., Wagner, E. The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. Journal of Biological Chemistry. 269, 12918-12924 (1994).
- Ratner, A. J., et al. Epithelial Cells Are Sensitive Detectors of Bacterial Pore-forming Toxins. Journal of Biological Chemistry. 281, 12994-12998 (2006).
- Saar, K., et al. Cell-penetrating peptides: A comparative membrane toxicity study. Analytical Biochemistry. 345, 55-65 (2005).
- Kichler, A., Leborgne, C., Coeytaux, E., Danos, O. Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study. The Journal of Gene Medicine. 3, 135-144 (2001).
- Behr, J. -. P. The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit. CHIMIA International Journal for Chemistry. 51, 34-36 (1997).
- Dawson, R. M. C., Elliot, D. C., Elliot, W. H., Jones, K. M. . Data for Biochemical Research. , (1986).
- Ernst, D. J. . Applied Phlebotomy. , (2005).
- Bulmus, V., et al. A new pH-responsive and glutathione-reactive, endosomal membrane-disruptive polymeric carrier for intracellular delivery of biomolecular drugs. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 93, 105-120 (2003).
- Lackey, C. A., et al. Hemolytic Activity of pH-Responsive Polymer-Streptavidin Bioconjugates. Bioconjugate Chemistry. 10, 401-405 (1999).
- Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs. Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).
- Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 61, 137-143 (1999).
- Yu, H., et al. Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery. ACS nano. 5, 9246-9255 (2011).
- Nelson, C. E., et al. Sustained local delivery of siRNA from an injectable scaffold. Biomaterials. 33, 1154-1161 (2012).
- Miozzari, G. F., Niederberger, P., Hütter, R. Permeabilization of microorganisms by Triton X-100. Analytical Biochemistry. 90, 220-233 (1978).
- Chen, H., Zhang, H., McCallum, C. M., Szoka, F. C., Guo, X. Unsaturated Cationic Ortho Esters for Endosome Permeation in Gene Delivery. Journal of Medicinal Chemistry. 50, 4269-4278 (2007).
- Roth, C. M. Quantitative Measurements and Rational Materials Design for Intracellular Delivery of Oligonucleotides. Biotechnology Progress. 24, 23-28 (2008).
- Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M. C., Pastan, I. pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus. Biochemistry. 25, 2231-2237 (1986).
- Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles. The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).
- Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery. The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).
