Biomacromolecular 일반 의약품의 Cytosolic 전송 산도 - 응답 Endosomolytic 에이전트의 평가에 대한 예 VIVO 레드 블러드 세포 용혈 분석
Summary
용혈 분석은 세포 내화물 배달 약물 전달 시스템 'cytocompatibility과 endosomolytic 활동의 빠른, 높은 처리량 화면으로 사용할 수 있습니다. 검정은 환경 산도의 함수로 적혈구 멤브레인의 중단을 측정합니다.
Abstract
엔도-lysosomal 소포를 구성 인지질의 bilayers은 세포 내 표적에 대한 생물학적 약물의 전달에 장벽을 야기 할 수 있습니다. 이 장벽을 극복하기 위해, 합성 약물 캐리어의 수는 적극적으로 endosomal 멤브레인을 방해하고 세포질로화물을 제공하도록 설계되었습니다. 여기, 우리는 세포 내 약물 전달 시스템의 cytocompatibility 및 endosomolytic 활동에 대한 신속하고 높은 처리량 화면으로 사용할 수있는 용혈 분석을 설명합니다.
용혈 분석에서 인간의 적혈구와 테스트 자료는 세포, 초기 endosomal, 늦은 엔도-lysosomal 환경을 모방 정의 PHS의 버퍼의 Co-incubated 수 있습니다. 펠렛 그대로 적혈구에 원심 분리 단계 후, 매체에 발표 헤모글로빈의 양이 spectrophotometrically (가장 동적 범위 405 nm의) 측정됩니다. %의 적혈구 장애는 이후 긍정적 인 제어 samp에 상대적으로 정량화된다레 세제로 lysed. 이 모델 시스템에서 적혈구 막에는 엔도-lysosomal 소포를 동봉 지질 이중층 막에 대한 대리 역할을합니다. 원하는 결과는 physiologic pH를 (7.4) 약 산도 5-6.8에서 엔도-lysosomal 산도 범위에서 강력한 용혈에서 무시할 용혈 수 있습니다.
Introduction
세포 내부에 많은 잠재적 영향력이 치료 대상이 있지만, 대리인의 세포 내 전달에 중요한 도전을 안겨주고 있습니다. 자주, 약물, 특히 biologics는 exocytosis를 통해 세포에 의해 internalized와 소포로 인신 매매 중 엔도-lysosomal 경로를 통해 내용의 저하로 연결, 또는 세포의 뒤쪽 shuttled 아르 수 있습니다. 후자의 과정에서 1 내부 pH는 소포의 효소의 활동을위한 최적의 산도입니다 약 5-6로 산성화되는 등 라이소자임 등이 칸에서 기능 2.
최근 자료 수는 특별히이 산성화가 자신의화물 cytosolic 전달을 촉진하기 endosomes 활용하여 설계되었습니다. 이 방법의 한 예는 그의 핵심 physiologic pH를 (예 : 7.4)에서 zwitterionic 및 충전 중립입니다 합성, 고분자 마이셀의 나노 입자를 사용합니다. 그러나, 산도 6.0에서- 6.5, 고분자는 protonated이되고 마이셀 코어를 destabilizes 그물 긍정적 인 요금을 습득하고, 노출 된 폴리머 세그먼트과 상호 작용할 수 있으며 endosomal 멤브레인을 방해. 이 활동은 그들의 cytosolic 목표에 액세스 할 수 있습니다 펩타이드 및 핵산 기반 치료학의 endosomal 탈출을 홍보하기 위해 표시되었습니다. 막 장벽을 방해 endosomal 탈출을 중재하기 위해 개발 방법의 3,4 다른 예는 또는 'fusogenic'펩티드를 포함 인지질 이중층에 막 융합 또는 과도 기공 형성을 중재 할 수 있습니다 단백질이. 같은 폴리 (propylacrylic 산)와 같은 음이온 알킬 아크릴 산의 5 Homopolymers 또 다른 잘 공부 접근 방법이며, 이러한 고분자에 펜던트 카르 복실 산의 protonation 상태를 전환 해주는 엔도-lysosomal 산도 범위에서 소수성으로, 막 중단 상태입니다. 6,7
endosomolytic 행동을 검사에 대해 하나의 유용한 모델 시스템은 전자입니다X 생체의 산도에 의존 용혈 분석 8.이 모델 시스템에서, 적혈구 막에는 엔도-lysosomal 소포를 동봉 지질 이중층 막에 대한 대리 역할을합니다. 이 generalizable 모델이 세포 관통 펩티드 및 기타 고분자 유전자 전달 시스템의 endosomolytic 행동을 평가하는 다른 사용되었습니다. 8-11이 실험에서 인간의 적혈구와 테스트 자료는 모방 정의 PHS에서 버퍼에 공동 incubated 아르 세포 (7.4), 초 (6.8) endosomal, 그리고 엔도-lysosomal 하순 (<6.8) 환경. 부화 기간 동안 출시 된 헤모글로빈의 양이 세제로 lysed 긍정적 인 제어 샘플에 출시 헤모글로빈의 양에 표준화되어 적혈구 용해의 측정으로 정량화되어 있습니다.
잠재적 endosomolytic 시험 자료의 작은 도서관을 심사에서, 하나는 산도 7.4에서 더 용혈을 생산하지 그 샘플을 추론하지만, 상당히 고농도의 헛기침 수산도 <6.5에서 olysis은 cytosolic 약물 전달을위한 가장 효과적이고 cytocompatible 후보 될 것입니다. 이 기준에 맞는 자료를 무차별 엔도-lysosomal 구획에 국제화에 따라 지역의 pH의 감소에 노출되는 때까지 지질 이중층의 세포막 (세포 독성을 일으킬 수 IE)를 파괴 불활성이 아닌 상태로 유지 될 것으로 예상됩니다.
이 프로토콜에서는 적혈구는 인간의 기증자로부터 분리되며, 산도 5.6, 6.2, 6.8, 또는 실험 endosomolytic 약물 전달 에이전트와 7.4에서 공동 incubated. 그대로 적혈구는 pelleted 있으며, supernatants은 (lysed 적혈구에서 출시 헤모글로빈을 포함) 플레이트 리더 (그림 1)를 통해 헤모글로빈의 특성 흡광도를 분석하고 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
endosomolytic 기능을 위해 설계 산도 – 응답 고분자 또는 다른 요원이 신속하게 될 효과적으로 endosome에서 발생 산도 값의 붉은 혈액 세포의 용해 (그림 1을 기준으로 검사를 할 수 있습니다, 산도 6.8 – 초기 endosome, 산도 6.2 – 늦은 endosome, pH를 5.6 – lysosome). 14-17 산도에 따라 달라 용혈은 biomacromolecular의 치료학 (예 : 펩티드, siRNA, ODNs, 단백질)의 endosomal 버전을 중재 할 사업자의…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 국방부를 통해 Congressionally 감독 의학 연구 프로그램 (# W81XWH-10-1-0445), 보건 국립 연구소 (NIH R21 HL110056)와 미국 심장 협회 (# 11SDG4890030)를 자금을 인정합니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BD Vacutainer – K2EDTA Vacutainer Tubes | Fisher Scientific | 22-253-145 | For blood collection |
| BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge | Fisher Scientific | 02-665-31 | For blood collection |
| BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter | Fisher Scientific | 22-289-953 | For blood collection |
| BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | For blood collection |
| BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet | Fisher Scientific | 02-657-6 | For blood collection |
| Hydrochloric acid (conc.) | Fisher Scientific | A144-500 | For adjustment of pH of D-PBS. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Positive control |
| Dulbecco’s PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
| BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-2C | For plate-reading at the end of the assay. |
| BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-17 | For incubation of red blood cells with experimental agents. |
References
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2002).
- Boasson, E. H. On the Bacteriolysis by Lysozyme. The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).
- Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery. J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).
- Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic. 7, 468-476 (2010).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., Wagner, E. The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. Journal of Biological Chemistry. 269, 12918-12924 (1994).
- Ratner, A. J., et al. Epithelial Cells Are Sensitive Detectors of Bacterial Pore-forming Toxins. Journal of Biological Chemistry. 281, 12994-12998 (2006).
- Saar, K., et al. Cell-penetrating peptides: A comparative membrane toxicity study. Analytical Biochemistry. 345, 55-65 (2005).
- Kichler, A., Leborgne, C., Coeytaux, E., Danos, O. Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study. The Journal of Gene Medicine. 3, 135-144 (2001).
- Behr, J. -. P. The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit. CHIMIA International Journal for Chemistry. 51, 34-36 (1997).
- Dawson, R. M. C., Elliot, D. C., Elliot, W. H., Jones, K. M. . Data for Biochemical Research. , (1986).
- Ernst, D. J. . Applied Phlebotomy. , (2005).
- Bulmus, V., et al. A new pH-responsive and glutathione-reactive, endosomal membrane-disruptive polymeric carrier for intracellular delivery of biomolecular drugs. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 93, 105-120 (2003).
- Lackey, C. A., et al. Hemolytic Activity of pH-Responsive Polymer-Streptavidin Bioconjugates. Bioconjugate Chemistry. 10, 401-405 (1999).
- Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs. Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).
- Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 61, 137-143 (1999).
- Yu, H., et al. Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery. ACS nano. 5, 9246-9255 (2011).
- Nelson, C. E., et al. Sustained local delivery of siRNA from an injectable scaffold. Biomaterials. 33, 1154-1161 (2012).
- Miozzari, G. F., Niederberger, P., Hütter, R. Permeabilization of microorganisms by Triton X-100. Analytical Biochemistry. 90, 220-233 (1978).
- Chen, H., Zhang, H., McCallum, C. M., Szoka, F. C., Guo, X. Unsaturated Cationic Ortho Esters for Endosome Permeation in Gene Delivery. Journal of Medicinal Chemistry. 50, 4269-4278 (2007).
- Roth, C. M. Quantitative Measurements and Rational Materials Design for Intracellular Delivery of Oligonucleotides. Biotechnology Progress. 24, 23-28 (2008).
- Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M. C., Pastan, I. pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus. Biochemistry. 25, 2231-2237 (1986).
- Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles. The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).
- Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery. The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).
