En hemolys analys kan användas som en snabb, hög genomströmning skärm av läkemedelsavgivningssystem "cytocompatibility och endosomolytic aktivitet för intracellulär leverans last. Analysen mäter störningar i erytrocytmembran som en funktion av miljön pH.
Fosfolipid dubbelskikt som utgör endo-lysosomala vesikler kan utgöra ett hinder för leverans av biologiska läkemedel till intracellulära mål. För att övervinna detta hinder, har ett antal syntetiska läkemedelsbärare konstruerats för att aktivt störa det endosomala membranet och leverera gods in i cytoplasman. Här beskriver vi den hemolys analys, som kan användas som en snabb, hög genomströmning skärm för cytocompatibility och endosomolytic aktivitet av intracellulära läkemedelsavgivningssystem.
I hemolys analysen är humana röda blodkroppar och material testa saminkuberas i buffertar vid definierade pH-värden som efterliknar extracellulära, tidig endosomala, och sen endo-lysosomala miljöer. Efter ett centrifugeringssteg för att pelletera intakta röda blodkroppar, är mängden hemoglobin frigjort i mediet spektrofotometriskt uppmätta (405 nm för bästa dynamikområde). Den procentuella röda blodkroppar störningar sedan kvantifieras i förhållande till positiv kontroll SAMPles lyseras med rengöringsmedel. I detta modellsystem erytrocyt membranet fungerar som ett surrogat för lipidbiskiktmembranet som innesluter endo-lysosomala vesiklar. Det önskade resultatet är försumbar hemolys vid fysiologiskt pH (7,4) och robust hemolys i endo-lysosomala pH-område från ca pH 5-6,8.
Även om det finns många potentiella stor genomslagskraft terapeutiska mål inuti cellen, utgör den intracellulära tillförsel av medel en stor utmaning. Ofta är läkemedel, särskilt biologiska, internaliseras av celler och smugglas in vesiklar som antingen leder till nedbrytning av deras innehåll genom endo-lysosomala vägen, eller pendlade tillbaka ut ur cellen via exocytos. 1 I den senare processen, den inre pH av vesiklarna surgöres till ca 5-6, vilket är det optimala pH för aktivitet av enzymer som fungerar i denna avdelning, såsom lysozym. 2
Nyligen har ett antal material har utvecklats särskilt för att utnyttja försurning av endosomer att underlätta cytosoliskt leverans av sin last. Ett exempel på detta tillvägagångssätt använder syntetiska, polymermicell nanopartiklar vars kärna är zwitterjoniska och laddnings-neutralt vid fysiologiskt pH (dvs 7,4). Emellertid, vid pH 6,0- 6,5, blir polymererna protoneras och förvärva en positiv nettoladdning som destabiliserar micellen kärnan, och de exponerade polymersegmenten interagerar med och störa det endosomala membranet. Denna verksamhet har visat sig främja endosomala flykten av peptid och nukleinsyra-baserade läkemedel, så att de kan komma åt sina cytosoliska mål. Inkluderar "fusogena" peptider eller 3,4 Andra exempel på metoder som utvecklats för att förmedla endosomal flykt som stör membranet barriären proteiner som kan mediera membranfusion eller övergående porbildning i fosfolipid dubbelskiktet. 5 Homopolymerer av anjoniska alkyl akrylsyror såsom poly (propylacrylic syra) är en annan väl studerade strategi, och i dessa polymerer, dikterar protonering tillstånd vidhängande karboxylsyra övergång till ett hydrofobt, membran-störande tillstånd i endo-lysosomala pH-områden. 6,7
En användbar modell för screening endosomolytic beteende är eX vivo pH-beroende hemolys analys. 8 I denna modell system tjänar erytrocyt membran som ett surrogat för lipidbiskiktmembranet som omsluter endo-lysosomala vesikler. Denna generaliserbar modell har använts av andra för att utvärdera endosomolytic beteende cellpenetrerande peptider och andra polymera gen leveranssystem. 8-11 I detta experiment humana röda blodkroppar och material testa är saminkuberas i buffertar vid definierade pH-värden som efterliknar extracellulära (7,4), tidig endosomala (6,8), och sen endo-lysosomala (<6,8) miljöer. Mängden hemoglobin frigörs under inkubationsperioden kvantifieras som ett mått på röda blodkroppar lys, som normaliseras till mängden hemoglobin frigörs i positiva kontrollprover lyserade med en detergent.
Från screening ett litet bibliotek av potentiellt endosomolytic testmaterial, kan en dra slutsatsen att prover som producerar ingen hemolys vid pH 7,4, men signifikant förhöjd fållolysis vid pH <6,5, kommer att vara de mest effektiva och cytocompatible kandidater för cytosoliskt drug delivery. Material som passar dessa kriterier skulle förväntas förbli inert och inte urskillningslöst förstör lipiddubbelskikts membran (dvs. som kan orsaka cytotoxicitet) tills att utsättas för en nedgång i den lokala pH-efter internalisering i endo-lysosomala fack.
I detta protokoll används erytrocyter isolerade från en human donator och sam-inkuberas vid pH 5,6, 6,2, 6,8 eller 7,4 med experimentella endosomolytic ämnen drug delivery. Intakta erytrocyter pelleteras, och supernatanterna (innehållande hemoglobin frigörs från lyserade erytrocyter) analyseras för karakteristiska absorbans av hemoglobin genom en plattläsare (figur 1).
pH-responsiva polymerer eller andra medel avsedda för endosomolytic funktion kan vara snabbt och effektivt screenas utifrån lys av röda blodkroppar vid pH-värden som uppstått i endosomen (figur 1, pH 6,8 – tidig endosome, pH 6,2 – sen endosome, pH 5,6 – lysosom). 14-17 pH-beroende hemolys har använts för att screena förmåga transportörer att mediera endosomala frisättning av biomacromolecular terapeutiska (t.ex. peptider, siRNA, ODN, proteiner), och resultaten av denna ana…
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner finansiering genom försvarsdepartementet congressionally riktade Medical Research Program (# W81XWH-10-1-0445), National Institutes of Health (NIH R21 HL110056) och American Heart Association (# 11SDG4890030).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
BD Vacutainer – K2EDTA Vacutainer Tubes | Fisher Scientific | 22-253-145 | For blood collection |
BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge | Fisher Scientific | 02-665-31 | For blood collection |
BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter | Fisher Scientific | 22-289-953 | For blood collection |
BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | For blood collection |
BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet | Fisher Scientific | 02-657-6 | For blood collection |
Hydrochloric acid (conc.) | Fisher Scientific | A144-500 | For adjustment of pH of D-PBS. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Positive control |
Dulbecco’s PBS | Invitrogen | 14190 | |
Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-2C | For plate-reading at the end of the assay. |
BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-17 | For incubation of red blood cells with experimental agents. |