Ex Vivo røde blodceller Hemolyse Assay for Evaluering av pH-responsive Endosomolytic Agenter for cytosoliske Levering av Biomacromolecular narkotika

Summary

En hemolyse Målingen kan brukes som en hurtig, høy-throughput skjermen stoffet leveringssystemer 'cytocompatibility og endosomolytic aktivitet for intracellulær last levering. Analysen måler avbrudd av erytrocytt membraner som en funksjon av miljømessige pH.

Abstract

Fosfolipid bilayers som utgjør endo-lysosomale vesikler kan utgjøre en barriere for levering av biologiske legemidler til intracellulære mål. For å overvinne denne barrieren, har en rekke syntetiske stoffer bærere blitt utviklet for å aktivt forstyrre endosomal membran og levere lasten til cytoplasma. Her beskriver vi hemolyse assay som kan brukes som hurtig, high-throughput skjermbildet for cytocompatibility og endosomolytic aktivitet av intracellulære stoffet leveringssystemer.

I hemolyse analysen, er humane røde blodceller og test materialer inkubert i buffere ved definerte pH-verdier som etterligner ekstracellulære, tidlig endosomal, og sent endo-lysosomale miljøer. Etter en sentrifugering trinn å pelletere intakte røde blodlegemer, er mengden av hemoglobin frigitt i mediet spektrofotometrisk målt (405 nm for beste dynamisk område). Det prosent røde blodlegemer avbrudd er da kvantifiseres i forhold til positive kontroll SAMPles lysert med vaskemiddel. I denne modellen systemet erytrocytt membranen fungerer som et surrogat for lipid bilayer membran som omslutter endo-lysosomale vesikler. Det ønskede resultatet er ubetydelig hemolyse ved fysiologisk pH (7,4) og robust hemolyse i endo-lysosomal pH varierer fra ca pH 5 til 6,8.

Introduction

Selv om det er mange potensielle høy effekt terapeutiske mål inne i cellen, utgjør den intracellulære levering av agenter en betydelig utfordring. Ofte er narkotika, spesielt biologiske, internalisert av celler og trafikkert til vesikler som enten fører til nedbrytning av innholdet gjennom endo-lysosomal sti, eller er skytteltrafikk tilbake ut av cellen via eksocytose. ^1. I sistnevnte prosessen, den interne pH av vesikler surgjøres til ca 5-6, som er den optimale pH for aktiviteten av enzymer som funksjon i denne avdeling, slik som lysozym. ²

Nylig har en rekke materialer er spesielt konstruert for å utnytte forsuring av endosomes å lette cytosoliske levering av lasten sin. Et eksempel på denne tilnærmingen bruker syntetiske, polymer micelle nanopartikler som kjernen er zwitterionisk og lade-nøytral ved fysiologisk pH (dvs. 7,4). Imidlertid, ved pH 6,0- 6.5, polymerene blir protonert og få en netto positiv ladning som destabiliserer micelle kjerne, og de eksponerte polymer segmentene samhandle med og forstyrre endosomal membran. Denne aktiviteten har blitt vist å fremme endosomal rømning av peptid og nukleinsyre-basert terapi, slik at de til å få tilgang til sine cytosoliske mål. ^3,4 Andre eksempler på metoder utviklet for å mediere endosomal flykte som forstyrre membranen barrieren inkluderer 'fusogenic' peptider eller proteiner som kan formidle membran fusjon eller forbigående poredannelse i fosfolipid bilayer. ⁵ Homopolymer av anioniske alkyl akrylsyrer slik som poly (propylacrylic syre) er en annen godt studert tilnærming, og i disse polymerer, dikterer protonering staten anheng karboksylsyre overgang inn i en hydrofob, membran-forstyrrende stat i endo-lysosomale pH-områder. ^6,7

Et nyttig modellsystem for screening endosomolytic oppførsel er ex vivo pH-avhengig hemolyse analysen. ⁸ I denne modellen systemet, serverer erytrocytt membranen som et surrogat for lipid bilayer membran som omslutter endo-lysosomale vesikler. Dette generalizable modellen har blitt brukt av andre til å evaluere endosomolytic oppførselen celle-gjennomtrengende peptider og andre polymere genet levering systemer. ^8-11 I dette eksperimentet, humane røde blodceller og testmaterialene er co-inkubert i buffere ved definerte pH-verdier som etterligner ekstracellulære (7,4), tidlig endosomal (6,8), og sent endo-lysosomal (<6,8) miljøer. Mengden av hemoglobin frigjort under inkubasjonstiden er kvantifisert som et mål på rødt blod cellelyse, som er normalisert til mengden hemoglobin utgitt i positive kontrollprøver lysert med vaskemiddel.

Fra screening et lite bibliotek av potensielt endosomolytic prøvemateriale, kan man antyde at prøvene som produserer ingen hemolyse ved pH 7,4, men signifikant forhøyet hemolysis ved pH <6.5, vil være den mest effektive og cytocompatible kandidater til cytosoliske levering av legemidler. Materialer som passer disse kriteriene forventes å forbli inert og ikke ukritisk ødelegge lipid bilayer membraner (dvs. som kan forårsake cytotoksisitet) til å bli utsatt for et fall i den lokale pH etter internalisering inn endo-lysosomale avdelinger.

I denne protokollen, er erytrocytter isolert fra en menneskelig donor og co-inkuberes på 5,6 pH, 6.2, 6.8, eller 7.4 med eksperimentelle endosomolytic levering av legemidler agenter. Intakte erytrocytter er pelletert, og supernatantene (som inneholder hemoglobin frigitt fra lyserte erytrocytter) analyseres for den karakteristiske absorbans av hemoglobin via en plateavleser (Figur 1).

Protocol

1. Forberedelse og sterilisering av buffere og Test Agenter 150 mM NaCl buffer: Oppløs 4,383 g NaCl krystaller i 500 ml nanopure vann. pH-buffere: Forbered fosfat buffere på 5,6 pH, 6,2, 6.8, og 7,4 ved å blande passende mengder av monobasisk og dibasisk natriumfosfat. Hvis prøvene skal testes ved lavere pH-verdier (dvs. pH <5,6) og deretter en mer hensiktsmessig buffer, for eksempel sitratbuffer, brukes. Bufferområder oppskrifter er lett tilgjengelig, og et eksempel referanse har b…

Representative Results

Vanligvis må agentene som utviser ideelle pH-avhengig hemolytisk atferd har høyest potensial for cytosoliske levering av legemidler, nukleinsyrer eller andre bioaktive molekyler. Dette eksemplifiseres av Agent # 1 som skildret i figur 2, som oppviser minimal hemolyse ved pH 7,4, men en sterk økning i hemolytisk atferd på endosomal pH-områder (<6,5). Noen midler kan vise betydelige nivåer av hemolytisk atferd ved fysiologiske pH-områder (Agent # 2 ved 40 ug / ml, figur 2),</strong…

Discussion

pH-responsive polymerer eller andre midler beregnet for endosomolytic funksjonen kan være raskt og effektivt screenet basert på lysis av røde blodlegemer ved pH-verdier som oppstår i endosome (figur 1; pH 6,8 – tidlig endosome, pH 6.2 – sen endosome, pH 5,6 – lysosomer). ^14-17 pH-avhengig hemolyse har blitt brukt til å skjerme evne bærere å mediere endosomal frigjøring av biomacromolecular legemiddelselskap (f.eks peptider, siRNA, ODNs, proteiner), og resultatene av denne ana…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BD Vacutainer – K2EDTA Vacutainer Tubes	Fisher Scientific	22-253-145	For blood collection
BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge	Fisher Scientific	02-665-31	For blood collection
BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter	Fisher Scientific	22-289-953	For blood collection
BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs	Fisher Scientific	13-680-63	For blood collection
BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet	Fisher Scientific	02-657-6	For blood collection
Hydrochloric acid (conc.)	Fisher Scientific	A144-500	For adjustment of pH of D-PBS.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Positive control
Dulbecco’s PBS	Invitrogen	14190
Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane	Fisher Scientific	09-740-44A
BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene	Fisher Scientific	08-772-2C	For plate-reading at the end of the assay.
BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene	Fisher Scientific	08-772-17	For incubation of red blood cells with experimental agents.