Ex vivo röda blodkroppar Hemolys analys för utvärdering av pH-responsiva Endosomolytic ombud för cytosoliskt Leverans av Biomacromolecular Droger

Summary

En hemolys analys kan användas som en snabb, hög genomströmning skärm av läkemedelsavgivningssystem "cytocompatibility och endosomolytic aktivitet för intracellulär leverans last. Analysen mäter störningar i erytrocytmembran som en funktion av miljön pH.

Abstract

Fosfolipid dubbelskikt som utgör endo-lysosomala vesikler kan utgöra ett hinder för leverans av biologiska läkemedel till intracellulära mål. För att övervinna detta hinder, har ett antal syntetiska läkemedelsbärare konstruerats för att aktivt störa det endosomala membranet och leverera gods in i cytoplasman. Här beskriver vi den hemolys analys, som kan användas som en snabb, hög genomströmning skärm för cytocompatibility och endosomolytic aktivitet av intracellulära läkemedelsavgivningssystem.

I hemolys analysen är humana röda blodkroppar och material testa saminkuberas i buffertar vid definierade pH-värden som efterliknar extracellulära, tidig endosomala, och sen endo-lysosomala miljöer. Efter ett centrifugeringssteg för att pelletera intakta röda blodkroppar, är mängden hemoglobin frigjort i mediet spektrofotometriskt uppmätta (405 nm för bästa dynamikområde). Den procentuella röda blodkroppar störningar sedan kvantifieras i förhållande till positiv kontroll SAMPles lyseras med rengöringsmedel. I detta modellsystem erytrocyt membranet fungerar som ett surrogat för lipidbiskiktmembranet som innesluter endo-lysosomala vesiklar. Det önskade resultatet är försumbar hemolys vid fysiologiskt pH (7,4) och robust hemolys i endo-lysosomala pH-område från ca pH 5-6,8.

Introduction

Även om det finns många potentiella stor genomslagskraft terapeutiska mål inuti cellen, utgör den intracellulära tillförsel av medel en stor utmaning. Ofta är läkemedel, särskilt biologiska, internaliseras av celler och smugglas in vesiklar som antingen leder till nedbrytning av deras innehåll genom endo-lysosomala vägen, eller pendlade tillbaka ut ur cellen via exocytos. ¹ I den senare processen, den inre pH av vesiklarna surgöres till ca 5-6, vilket är det optimala pH för aktivitet av enzymer som fungerar i denna avdelning, såsom lysozym. ²

Nyligen har ett antal material har utvecklats särskilt för att utnyttja försurning av endosomer att underlätta cytosoliskt leverans av sin last. Ett exempel på detta tillvägagångssätt använder syntetiska, polymermicell nanopartiklar vars kärna är zwitterjoniska och laddnings-neutralt vid fysiologiskt pH (dvs 7,4). Emellertid, vid pH 6,0- 6,5, blir polymererna protoneras och förvärva en positiv nettoladdning som destabiliserar micellen kärnan, och de exponerade polymersegmenten interagerar med och störa det endosomala membranet. Denna verksamhet har visat sig främja endosomala flykten av peptid och nukleinsyra-baserade läkemedel, så att de kan komma åt sina cytosoliska mål. Inkluderar "fusogena" peptider eller ^3,4 Andra exempel på metoder som utvecklats för att förmedla endosomal flykt som stör membranet barriären proteiner som kan mediera membranfusion eller övergående porbildning i fosfolipid dubbelskiktet. ⁵ Homopolymerer av anjoniska alkyl akrylsyror såsom poly (propylacrylic syra) är en annan väl studerade strategi, och i dessa polymerer, dikterar protonering tillstånd vidhängande karboxylsyra övergång till ett hydrofobt, membran-störande tillstånd i endo-lysosomala pH-områden. ^6,7

En användbar modell för screening endosomolytic beteende är eX vivo pH-beroende hemolys analys. ⁸ I denna modell system tjänar erytrocyt membran som ett surrogat för lipidbiskiktmembranet som omsluter endo-lysosomala vesikler. Denna generaliserbar modell har använts av andra för att utvärdera endosomolytic beteende cellpenetrerande peptider och andra polymera gen leveranssystem. ^8-11 I detta experiment humana röda blodkroppar och material testa är saminkuberas i buffertar vid definierade pH-värden som efterliknar extracellulära (7,4), tidig endosomala (6,8), och sen endo-lysosomala (<6,8) miljöer. Mängden hemoglobin frigörs under inkubationsperioden kvantifieras som ett mått på röda blodkroppar lys, som normaliseras till mängden hemoglobin frigörs i positiva kontrollprover lyserade med en detergent.

Från screening ett litet bibliotek av potentiellt endosomolytic testmaterial, kan en dra slutsatsen att prover som producerar ingen hemolys vid pH 7,4, men signifikant förhöjd fållolysis vid pH <6,5, kommer att vara de mest effektiva och cytocompatible kandidater för cytosoliskt drug delivery. Material som passar dessa kriterier skulle förväntas förbli inert och inte urskillningslöst förstör lipiddubbelskikts membran (dvs. som kan orsaka cytotoxicitet) tills att utsättas för en nedgång i den lokala pH-efter internalisering i endo-lysosomala fack.

I detta protokoll används erytrocyter isolerade från en human donator och sam-inkuberas vid pH 5,6, 6,2, 6,8 eller 7,4 med experimentella endosomolytic ämnen drug delivery. Intakta erytrocyter pelleteras, och supernatanterna (innehållande hemoglobin frigörs från lyserade erytrocyter) analyseras för karakteristiska absorbans av hemoglobin genom en plattläsare (figur 1).

Protocol

1. Beredning och Sterilisering av Buffertar och ombud Test 150 mM NaCl-buffert: Lös 4,383 g NaCl kristaller i 500 ml nanorent vatten. pH-buffertar: Förbered fosfatbuffertar vid pH 5,6, 6,2, 6,8, och 7,4 genom att blanda lämpliga mängder av monobasiskt och dibasiskt natriumfosfat. Om proverna ska testas vid lägre pH-värden (dvs. pH <5,6) sedan en mer lämplig buffert, såsom citratbuffert, bör användas. Buffer recept är lätt tillgängliga, och ett exempel referens har lämnats h…

Representative Results

Typiskt medel som uppvisar ideala pH-beroende hemolytisk beteende har den högsta potentialen för cytosoliskt leverans av läkemedel, nukleinsyror eller andra bioaktiva molekyler. Detta exemplifieras av Agent # 1 såsom skildras i figur 2, som uppvisar minimal hemolys vid pH 7,4, men en kraftig ökning av hemolytisk beteende vid endosomala pH-intervall (<6,5). Vissa medel kan uppvisa en hög grad av hemolytisk beteende vid fysiologiska pH-områden (ombud # 2 vid 40 pg / ml; figur 2),</…

Discussion

pH-responsiva polymerer eller andra medel avsedda för endosomolytic funktion kan vara snabbt och effektivt screenas utifrån lys av röda blodkroppar vid pH-värden som uppstått i endosomen (figur 1, pH 6,8 – tidig endosome, pH 6,2 – sen endosome, pH 5,6 – lysosom). ^14-17 pH-beroende hemolys har använts för att screena förmåga transportörer att mediera endosomala frisättning av biomacromolecular terapeutiska (t.ex. peptider, siRNA, ODN, proteiner), och resultaten av denna ana…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BD Vacutainer – K2EDTA Vacutainer Tubes	Fisher Scientific	22-253-145	For blood collection
BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge	Fisher Scientific	02-665-31	For blood collection
BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter	Fisher Scientific	22-289-953	For blood collection
BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs	Fisher Scientific	13-680-63	For blood collection
BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet	Fisher Scientific	02-657-6	For blood collection
Hydrochloric acid (conc.)	Fisher Scientific	A144-500	For adjustment of pH of D-PBS.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Positive control
Dulbecco’s PBS	Invitrogen	14190
Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane	Fisher Scientific	09-740-44A
BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene	Fisher Scientific	08-772-2C	For plate-reading at the end of the assay.
BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene	Fisher Scientific	08-772-17	For incubation of red blood cells with experimental agents.