Summary
Taxa de crescimento celular é um processo regulado e um dos principais determinantes da fisiologia celular. Cultura contínua usando quimiostatos permite o controle extrínseco da taxa de crescimento celular por limitação de nutrientes facilitar o estudo de redes moleculares que controlam o crescimento celular e como essas redes de evoluir para otimizar o crescimento celular.
Abstract
Células regular sua taxa de crescimento em resposta a sinais do mundo externo. À medida que a célula cresça, diversos processos celulares deve ser coordenado, incluindo a síntese de macromoléculas, o metabolismo e, em última instância, o compromisso com o ciclo de divisão celular. O quimiostato, um método de controlar a taxa de crescimento experimental de células, proporciona um meio poderoso de estudar sistematicamente como os impactos a taxa de crescimento de processos celulares, incluindo a expressão de genes - e metabolismo - e as redes reguladoras que controlam a taxa de crescimento celular. Quando mantido por centenas de gerações quimióstatos podem ser usadas para estudar a evolução adaptativa de micróbios em condições ambientais que limitam o crescimento das células. Descreve-se o princípio de cultivos contínuos, demonstrar seu funcionamento e dar exemplos de suas diversas aplicações. Após um período de desuso após a sua introdução em meados do século XX, a convergência das metodologias genoma escala com uma renovada emteresse na regulação do crescimento celular e as bases moleculares da evolução adaptativa está estimulando um renascimento no uso de quimiostatos na pesquisa biológica.
Introduction
O crescimento das células é regulada por redes complexas de interagir factores genéticos e ambientais 1,2. O regulamento multifatorial do crescimento celular exige uma abordagem em nível de sistema para seu estudo. No entanto, o estudo rigoroso do crescimento celular regulamentada é desafiado pela dificuldade de controlar experimentalmente a velocidade com que as células crescem. Além disso, até mesmo nas experiências mais simples condições extracelulares são freqüentemente dinâmico e complexo como as células alteram continuamente o seu ambiente à medida que proliferam. Uma solução para estes problemas é fornecido pelo quimiostato: um método de cultura de células que permite o controlo das taxas de crescimento experimental de células em ambientes definidos, invariante e controladas.
O método de cultura contínua usando um quimiostato foi descrito de forma independente por Monod 3 e Novick & Szilard 4 em 1950. Como originalmente concebida, as células são cultivadas em um volume fixo de mídia que é connuamente diluída pela adição de novas mídias e remoção simultânea de mídias antigas e células (Figura 1). Acoplado equações diferenciais ordinárias (Figura 2) descrevem a taxa de variação da densidade de células (x) e a concentração de um nutriente limitante do crescimento (s) no recipiente de quimiostato. Importante, este sistema de equações prevê uma única (não-zero) estável no estado estacionário (Figura 3), com a implicação notável que, no estado estacionário, a taxa de crescimento específico das células (ou seja, a constante da taxa de crescimento exponencial) é igual à taxa em que a cultura é diluída (D). Através da variação da taxa de diluição é possível estabelecer populações de estado estacionário de células em diferentes taxas de crescimento e sob diferentes condições de limitação de nutrientes.
O controle experimental da taxa de crescimento usando quimiostatos foi fundamental para o desenvolvimento de uma compreensão de como as mudanças fisiologia celularcom taxas de crescimento de 5,6. No entanto, este antigo pilar de métodos microbiológicos tornou-se cada vez mais obscuro durante a explosão na investigação em biologia molecular, durante o final do século XX. Hoje, renovou o interesse no controlo do crescimento de ambos os micróbios e organismos multicelulares e o advento de métodos genoma escala para análise de sistemas de nível renovou motivação para a utilização de quimióstatos. Aqui, descrevemos três aplicações que capitalizar sobre o controle preciso das taxas de crescimento das células e para o ambiente externo que são exclusivamente possível usando quimiostatos. Em primeiro lugar, descreve-se o uso de quimióstatos para investigar a forma como a abundância de milhares de biomoléculas - como transcritos e metabolitos - são coordenadamente regulada com a taxa de crescimento. Em segundo lugar, nós descrevemos como quimiostatos pode ser usada para obter estimativas precisas das diferenças de taxas de crescimento entre os diferentes genótipos em ambientes com limitação de nutrientes, utilizando experimentos de competição. Em terceiro lugar, nós descrevemos como quimiostatos podeser usado para estudar evolução adaptativa de células que crescem em ambientes pobres em nutrientes constantes. Estes exemplos exemplificar as formas em que quimiostatos estão permitindo investigações em sistemas de nível de regulação do crescimento celular, gênica por interações ambientais e evolução adaptativa.
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Protocol
O princípio da cultura contínua usando um quimiostato pode ser realizado em uma variedade de implementações. Em todos os quimióstatos é essencial ter um) métodos para manter a esterilidade de todos os componentes, 2) uma cultura bem misturada, 3) arejamento adequado do vaso de cultura e 4) um meio confiável de adição e remoção de meios de cultura. Aqui, descrevemos a utilização de um bioreactor de Sixfors (Infors Inc) como um quimiostato utilizando métodos que podem ser prontamente adaptados para configurações alternativas.
1. Montagem das embarcações chemostat
- Ligue os Sixfors usando o interruptor principal.
- Lave bem o recipiente chemostat, montagem agitador, e tubos ligados com deionizada (DI) de água. Confira toda a tubulação e o-rings e substituir quaisquer peças desgastadas procurando.
- Certifique-se a base de apoio veio de accionamento está virada para cima no recipiente de vidro e que a parte superior do veio de accionamento é encaixado no seu alojamento no conjunto agitador. Defina o stirremontagem r-se no reactor de vidro assegurando a parte inferior do veio de accionamento está encaixado no suporte de eixo rígido. Use o grampo para fixar o conjunto do agitador para o recipiente de vidro.
- Encher o vaso com cerca de 300 ml de água DI.
- Retire as tampas de um oxigênio dissolvido (OD 2) sonda e verificar o nível do eletrólito, desapertando a carcaça inferior e certificando-se de que a caixa do fundo está cheio até a metade com solução eletrolítica. Rescrew o revestimento inferior e inserir na porta do navio chemostat. Aperte até dedo apertado.
- Dê uma sonda de pH e removê-lo de seu buffer de armazenamento (3 M KCl). Retire a tampa da sonda de pH e anexar ao fermentador 1. Usando a tela de controle Sixfors, navegue até o menu de parâmetros de fermentação e selecione "calibrar pH". Coloque a sonda de pH em um buffer padrão pH 7 e registre a leitura como alta Read. Repita com tampão pH 4 e registre a leitura como Low Read. Retire a sonda de pH do fermentador, lavar com água DI e introduzir a sonda into porto no navio chemostat. Aperte até dedo apertado.
- Colocar o recipiente chemostat no rack. Nota sobre a embarcação que fermentador (1-6) a sonda de pH foi conectada e calibrado. Coloque a tampa da sonda de pH na sonda de pH. Usando folha de cobrir bem a parte superior da sonda DO 2.
- Dobrar a folha ao longo das extremidades do tubo ligado ao recipiente de quimiostato.
- Repita os passos de 1,2-1,8 para todas as embarcações.
- Esterilizar por autoclavagem dos vasos lhes durante 15 minutos num ciclo de líquidos.
2. Preparação da mídia
- Estabelecer a faixa-limite de concentração de um nutriente por uma crescente cultura de lotes em diferentes concentrações de nutrientes. O nutriente é limitante na gama em que a densidade celular final é uma função linear da concentração de nutrientes inicial (Figura 4). Selecione uma concentração de nutrientes bem dentro da faixa de limitação. Exemplos de composição de mídia padrão para estudos com Saccharomyces cerevisiae estão disponíveis em 7-11.
- Autoclave um garrafão vazio que é tapado com uma rolha de borracha que contém uma entrada de ar e meios de saída após a primeira assegurando que a extremidade do tubo de media está coberta em folha.
- Em um recipiente separado preparar 10 L de meios de comunicação.
- Coloque uma xícara de 500 ml de filtro para um frasco de 100 ml de mídia. Retire o filtro de algodão com uma pinça esterilizados em etanol e anexar imediatamente à porta filtração no garrafão mídia.
- Prenda o garrafão de mídia a uma fonte de vácuo e filtro de esterilizar mídia, adicionando-o ao copo do filtro.
- Quando filtração dos meios de comunicação é completa, fechar a porta de filtração com uma braçadeira de metal.
3. Calibrar fazer 2 Sondas e Configurando chemostat
- Depois de os vasos em quimiostato foram autoclavados e deixou-se arrefecer o lugar do navio no seu revestimento de calor correspondente. Ligue o sensor de temperatura, sonda de pH, e fazer 2 sonda. Deixe onavio sentar-se com o poder por pelo menos 6 horas para permitir que os fazer 2 sondas de polarizar.
- Coloque a extremidade de cada tubo de efluentes em um receptáculo de coleta separado. Conecte o suprimento de ar através de um filtro autoclavado e ativar o fluxo de ar. A água em cada navio deverá sair dos tubos de efluentes, o que indica que todos os selos são devidamente formado.
- Ajustar a altura do tubo efluente de acordo com o volume de trabalho desejado (por exemplo, 300 ml). Usamos uma régua que está marcado com a colocação de tubos calibrados para diferentes volumes de trabalho.
- Conecte o garrafão de mídia para o navio chemostat. Use etanol, a fim de manter o tubo termina como estéril quanto possível. Passe a tubulação da bomba através da bomba e pinça aberta. Pressionar manualmente a bomba até que a mídia começa a fluir para dentro do vaso chemostat. Solte a tubulação da bomba, a mídia deve fluir livremente para dentro do vaso chemostat. Quando a mídia atinge o tubo de efluentes, recoloque a tubulação à bomba e pinça.
- Comece running o programa básico com impulsor conjunto a 400 rpm e a temperatura fixada em 30 ° C.
- Para calibrar fazer 2 sondas, desligue o suprimento de ar e mudar para o gás nitrogênio. Espere pelo menos uma hora e registro de valor medida como "baixo de leitura". Volte para o fornecimento de ar (ou seja, contendo concentração de oxigênio ambiente), espere pelo menos uma hora e medição registro como "alta de leitura".
- Iniciar a gravação de dados usando o software Iris.
4. Inoculação
- Usar 70% de etanol para esterilizar a parte superior do vaso de cultura.
- Remover o parafuso na parte superior do vaso e pipeta de 1 ml de uma cultura durante a noite para dentro do vaso quimiostato. Volte a apertar o parafuso.
- Indique o tempo de inoculação em Iris.
- Espere cerca de 24 horas para que as culturas para atingir fase estacionária adiantada. À medida que a cultura cresce, oxigênio dissolvido e pH diminuirá. No caso dos meios de limitação de glucose, oxigénio dissolvido voltará a ~ 100% em pha estacionáriasi. Por outras limitações nutricionais oxigénio dissolvido permanecerá <100% na fase estacionária.
5. Iniciando Bombas e Atingir estado estacionário
- A taxa de diluição é calculada dividindo o caudal (quanto mídia flui para dentro do vaso por hora) através do volume de cultura. Por exemplo, usando um volume de 300 ml, uma taxa de diluição de 0,1 significa que 30 ml de meio é adicionada à cultura a cada hora. Uma vez que o sistema se encontra sob pressão positiva o mesmo volume é removido a partir do vaso de assegurar que a cultura é continuamente diluído. Uma gama de taxas de diluição (D) pode ser usado, que não excedam a taxa máxima de crescimento (μ max) das células, acima do qual as células serão lavadas para fora do chemostat.
- Escolha as configurações de bomba, que especificam o número de segundos a bomba é ligado e desligado, para estabelecer a vazão desejada. A bomba fornece meios de comunicação, a uma taxa de ~ 0,11 ml / seg.
- Definir um programa usando o Sixfors interface que especifica o tempo da bomba, a temperatura ea velocidade do rotor. Inicie o programa.
- Esvazie os recipientes de coleta de líquido e registrar o tempo.
- Depois de pelo menos duas horas, utilizar uma proveta para medir a quantidade de meios de comunicação tenha sido removido a partir do vaso. Isto será igual ao volume que foi adicionado ao recipiente de quimiostato. Calcular a taxa de diluição (D = V efluentes / V Cultura / tempo). Ajuste as configurações da bomba se a taxa de diluição calculada não coincide com taxa de diluição desejada.
- No estado estacionário, a densidade celular no quimiostato não muda ao longo do tempo. Isto pode ser medido sem perturbar a cultura através da amostragem do fluxo de saída. Nós operacionalmente definir atingir o estado estacionário como medições da densidade de células idênticas que são separadas por pelo menos uma duplicação da população. Alcançando estado estacionário levará aproximadamente oito gerações de cultura após o início da diluição da cultura. No estado de equilíbrio, as células crescem exponencialmente (i.e. taxa de crescimento constante ao longo do tempo), em condições limitadas em nutrientes. O tempo de duplicação da população (tempo de geração) é ln (2) / D.
- Continuar a medir periodicamente efluentes para a duração da experiência para assegurar que uma taxa de diluição é mantida constante.
6. Aplicação 1: estudar as células a crescer a taxas diferentes em condições de estado estacionário
- No estado estacionário no quimiostato, a taxa de crescimento da população de células é igual à taxa de diluição. Ao alterar sistematicamente a taxa de diluição é possível cultivar células em taxas diferentes. Isso permite que o estudo sistemático de parâmetros fisiológicos que variam de acordo com a taxa de crescimento, incluindo o volume da célula, o estágio do ciclo celular e resistência ao estresse. Além disso, os perfis de estado estacionário de ARNm globais, proteína e níveis de metabolito pode ser ensaiada em células em crescimento em taxas diferentes. Há duas maneiras de adquirir amostras:
- Pequenas amostras podem ser passivamente obretidos pela colocação da extremidade do tubo efluente em um tubo de 1,5 ml ou 15 ml. Uma amostra de 1-5 ml pode ser obtido em poucos minutos (dependendo da velocidade de fluxo). Muitos parâmetros fisiológicos pode ser medido a partir dessas amostras.
- Expressão de genes, ou de metabolito análises exigem maiores amostras que devem ser obtidos mais rapidamente possível. Coloque a extremidade do tubo efluente em um tubo cónico de 15 ml. Solte o parafuso que prende a ponta de metal do tubo de efluentes e empurrar para baixo suavemente. A ~ 10 ml de amostra vai rapidamente preencher o seu tubo. Tenha em atenção que o volume no vaso de quimiostato mudou. Se várias amostras consecutivas são tomadas pode ser necessário para reduzir o fluxo para manter uma taxa de diluição constante.
7. Aplicação 2: Medição precisa das diferenças de taxas de crescimento entre os genótipos em ambientes controlados usando ensaios de competição baseados em citometria de fluxo
- Quimióstatos pode ser utilizado para quantificar com precisão o efeito da concentração de nutrientessobre as diferenças nas taxas de crescimento (ou seja, de aptidão) entre diferentes origens genéticas. Por estirpes de co-cultura marcados com diferentes proteínas fluorescentes a taxa de alteração na abundância relativa durante o crescimento exponencial é determinada. A realização deste ensaio, em diferentes taxas de diluição (D) permite o estudo dos efeitos de concentração de nutrientes (s) sobre as diferenças de aptidão.
- Estabelecer culturas de estado estacionário das duas linhagens nos vasos quimiostato separadas com taxas de diluição idênticos e um volume de 300 ml.
- Passivamente amostra 1 ml de cada navio. Gire as células, ressuspender em tampão fosfato (PBS) e colocar a 4 ° C. Estas amostras contêm amostras de células homogêneas, que são controles para a análise de citometria de fluxo subseqüente.
- Coloque o tubo de efluentes de um navio em um cilindro graduado autoclavado. Solte o parafuso que prende a ponta de metal do tubo de efluentes e empurre para baixo para expelir as células do chemostat. Quandoo volume atinge 150 ml, devolver o metal final do tubo efluente para a sua posição original (300 ml). Repetir com o segundo vaso, utilizando uma proveta graduada diferente.
- Use etanol a 70% para manter a esterilidade durante a remoção do parafuso na parte superior do vaso de quimiostato. Coloque funil na abertura e despejar 150 ml de outra cultura no vaso quimiostato. Volte a apertar o parafuso. Repetir com o segundo vaso, usando o segundo funil. Cada vaso quimiostato agora contém uma mistura das duas estirpes.
- Obter uma amostra de 1 ml de cada navio utilizando amostragem passiva cada 2-6 horas. Gire as células, ressuspender em PBS e armazenar a 4 ° C. Continue a tomar amostras para a gravação de 2-3 dias com cuidado o tempo que cada amostra foi colhida.
- No fim do experimento, sonicado e diluir as amostras a ~ 2 x 10 6 células / ml. Utilizando citometria de fluxo, medir a proporção das duas estirpes em cada amostra. Como ambas as tensões estão crescendo exponencialmente, a diferença da taxa de crescimento relativo édeterminada por regressão linear de ln (strain1/strain2) contra o tempo (medido em gerações). O declive da regressão é proporcional à diferença na taxa de crescimento (isto é, a vantagem de fitness) de uma estirpe em relação à outra.
- Como a cultura mista pode levar algum tempo para atingir um novo estado de equilíbrio, momentos precoce pode caber mal à regressão. Esta questão é melhor resolvido, permitindo 2-3 gerações a decorrer antes de iniciar a amostragem ou removendo pontos iniciais, que são valores atípicos claras. Por outro lado, uma vez que uma cepa tem suplantado o outro os dados não são mais úteis e esses pontos devem ser excluídos.
8. Aplicação 3: Evolução Experimental
- Evolução Experimental realizado em quimiostatos seleciona para mutantes que são aumentados em fitness no ambiente limitado em nutrientes. Seleção geralmente é realizada ao longo de centenas de gerações.
- Estabelecer uma cultura chemostat estado estacionário utilizando uma cepagenótipo do conhecido (e seqüência do genoma de preferência conhecida) e um nutriente-limitação definida.
- Para manter um "registro fóssil" da população adaptação passiva provar chemostat cada 2-3 dias e armazenar a amostra em 15% de glicerol a -80 ° C.
- Monitorar o reservatório mídia e reabastecer com meios frescos, se necessário.
- Manter a cultura exponencialmente crescente de várias centenas de gerações.
- Após a conclusão da placa de selecção de uma amostra de células em placas de agar sólido. Após as células se transformaram em colônias, pegar uma amostra imparcial de colônias usando palitos de dente e inocular clones em poços individuais de uma placa de 96 poços contendo 100 ml de mídia. Permitir amostras clonais para crescer durante a noite, adicionar 100 ml de 30% de glicerol e armazenar em -80 ° C.
- Caracterizar clones por seqüenciamento do genoma inteiro e realizando ensaios fenotípicos, incluindo a avaliação de aptidão física, utilizando uma estirpe de referência comum fluorescente etiquetado, conforme descrito na Aplicação 2. </ Li>
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Representative Results
Uma grande vantagem do quimióstatos é a capacidade de controlar a taxa de crescimento das células experimentalmente ao variar a taxa de diluição. Na brotação levedura, Saccharomyces cerevisiae, a morfologia de uma célula é informativo da fase do ciclo de divisão celular. As populações com taxas de crescimento superiores contêm uma maior proporção de células em divisão activa tal como determinado através da medição da fracção de células não gemuladas (Figura 5A). Análises de expressão do mRNA global em culturas em quimiostato mostrou que a expressão de muitos genes diferencialmente expressos como uma função da taxa de crescimento (Figuras 5B e Figura 5C).
A aptidão relativa dos diferentes genótipos pode ser determinada através da realização de ensaios de competição em quimióstatos usando células marcadas por fluorescência e citometria de fluxo (Figura 6A). Figura 6B mostra um resultado representativo em que uma estirpe mutante foi comple peted contra uma cepa fluorescente etiquetado tipo selvagem. Neste exemplo, a estirpe mutante tem uma vantagem de taxa de crescimento de 40% por geração. Em comparação, uma cepa do tipo selvagem untagged competiu contra o fluorescente etiquetado wildtype tensão não difere em sua taxa de crescimento.
Quimióstatos fornecer um meio para exercer uma pressão selectiva e contínua definida em células. A análise da sequência do genoma inteiro pode ser usado para identificar mutações adquiridas em células com aptidão aumentada. Experimentos evolução adaptativa em células de levedura em diferentes quimiostatos limitados nutrientes identificaram variantes do número de cópia como um mecanismo freqüente e repetido pelos quais mutações adaptativas são gerados. Por exemplo, em experiências de evolução adaptativa independentes realizados em quimióstatos limitado de azoto utilizando diferentes fontes de azoto, o número de cópias múltiplas variantes (VNCs) que inclui o gene GAP1 foram identificados 11 (Figura 7).
t "> quimiostatos colocam alguns desafios únicos que não são outra forma encontradas em métodos microbiológicos padrão. Possíveis problemas e soluções específicas para chemostat experimentos podem ser encontrados na Tabela 1.
Figura 1. Diagrama de um chemostat. Chemostat O compreende um reservatório de mídia, bomba, uma embarcação chemostat, um tubo de efluentes, e um vaso coletor.
Figura 2. Modelo matemático do quimiostato. Equação diferencial 1 descreve a mudança na densidade de células (x) no quimiostato ao longo do tempo, que é o resultado do crescimento celular e remoção das células por diluição (morte celular é considerado negligenciável). Monod proposto 3 que o crescimento celular (μ) dependems na concentração de nutrientes externa de acordo com um tipo de relação de Michaelis-Menten, que inclui as variáveis de taxa máxima de crescimento (μ max) e uma constante de velocidade de crescimento semi-máxima (K s). A taxa de diluição (D) é determinada pela velocidade de adição e remoção de meios de cultura. Equação diferencial 2 descreve a taxa de alteração na concentração nutriente limitante (s) no recipiente de quimiostato. A alteração na concentração do nutriente limitante no vaso quimiostato é dependente da sua concentração no meio de entrada do sistema (R), a sua diluição pelo fluxo de saída (D) e o consumo pelas células, o que é dependente dos parâmetros de célula μ max, K s e um rendimento constante, Y. Para simplificação, Y é assumido ser constante a diferentes taxas de crescimento. As variáveis e suas unidades típicas, nas equações diferenciais ordinárias acopladas são x - tocas celularesdade (células / ml), s - limitando a concentração de nutrientes (M), μ max - taxa de crescimento máxima (h -1), K s - a concentração de nutrientes em que a taxa de crescimento é igual a max μ / 2 (M), Y - rendimento (células / ml / M), D - taxa de diluição (hr-1), R - concentração de nutrientes no reservatório de mídia (mm).
Figura 3. Abordagem à concentração no estado de equilíbrio, como previsto pelo modelo matemático. Nutrientes (vermelho) e densidade de células (azul) atingir diferentes de zero estados estacionários.
Figura 4. Estabelecendo o intervalo de um nutriente limitante. Saccharomyces cerevisiae foi cultivado em diferentes concentrações de glucose e a densidade final determinada. Uma relação linear que indica a concentração de nutrientes está na gama de limitação.
Tabela 1. Tabela de problema e as possíveis soluções. 
Figura 5. Fisiologia celular varia com a taxa de crescimento. Do quimiostato permite estudos controlados que a relação entre a taxa de crescimento e A) a divisão celular como ensaiado com base na morfologia das células (isto é, a fracção de células enxertadas). A abundância de ~ 25% do ARNm de levedura depende da taxa de crescimento: por exemplo, o gene B) UTR2 aumentos na expressão como os aumentos da taxa de crescimento, tanto em glicose-(O) e (Δ) quimióstatos limitado de azoto e o gene C) Asm1 diminui em nível de expressão à medida que aumenta a taxa de crescimento em glicose-(o) e com limitação de nitrogênio (Δ) quimiostatos 10. 
Figura 6. Ensaios de competição Strain em quimiostatos. A) Dois estirpes que são diferencialmente marcadas por proteínas fluorescentes constitutivamente expressas são co-cultivadas num quimiostato e a taxa de alteração na abundância relativa de ambas as estirpes é determinada a cada 2-4 gerações, utilizando citometria de fluxo. B) A aptidão relativa de uma estirpe é determinada por regressão linear do logaritmo natural (ln) do ratio das duas cepas contra o tempo medido em gerações. Clique aqui para ver maior figura . 
Figura 7. Seleção a longo prazo em quimiostatos seleciona de forma eficiente para os mutantes com maior aptidão. Análise do genoma escala de mutantes identificou rearranjos cromossômicos freqüentes e copiar variação do número (CNV) em mutantes com maior aptidão. Experimentos independentes evolução adaptativa em diferentes condições de limitação de azoto resulta na selecção de diferentes alelos de CNV no locus GAP1 (demarcado por linhas pontilhadas cinzento), o qual codifica a permease aminoácido geral. Cada ponto de dados representa a proporção entre o número de cópias de ADN da estirpe evoluída em comparação com o de umtensão cestral medida usando um microarray de DNA que analisa simultaneamente cada gene (preto). Problema Solução Um pH baixo no recipiente de cultura. O pH pode ser monitorizado em tempo real e controlada por adição automática de ácido / base. Em alternativa, meios tamponados podem ser utilizados. Células floculantes e biofilmes em recipiente de cultura. Mantenha cultura bem misturado, executando impellor em> 400 rpm. O crescimento em linhas de alimentação de mídia. O uso de filtros no porto de entrada reduz o potencial de colonização de linhas de alimentação de material. Sincronização celular e estáveis fazer 2 oscilações iquimiostatos limitados n carbono. Estes podem ser evitados utilizando as taxas de diluição mais elevadas e evitar longos períodos de privação de alimento antes do início da diluição da cultura.
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Discussion
Quimióstatos permitir o cultivo dos microrganismos em condições de estado estacionário de crescimento controlado. As células crescem continuamente a uma velocidade constante, resultando em um ambiente externo invariante. Isto está em contraste com os métodos de cultura em lotes em que o ambiente externo está em constante mudança e a taxa de crescimento das células é determinado pela interacção complexa de ambiente e genótipo. Assim, uma importante vantagem da cultura de micróbios em quimióstatos mais culturas de lote é a capacidade de controlar a taxa de crescimento experimental de células.
A taxa à qual uma célula cresce é o resultado de interacções entre os processos celulares, incluindo a detecção miríade de nutrientes, a transdução de sinal, a síntese de macromoléculas e do metabolismo. Usando quimiostatos em combinação com métodos analíticos globais permite a investigação de como os processos fundamentais a taxa de impactos de crescimento da célula e, inversamente, como a célula regula e coordena processo celular coma sua taxa de crescimento. Os estudos em células de tipo selvagem demonstraram que as concentrações celulares de RNA e de proteínas são profundamente influenciado pelas taxas de crescimento da célula 6 e mais recentemente, tem sido mostrado que o transcriptoma 10,12,13 e metaboloma 8 são drasticamente impactado pelas taxas de crescimento da célula.
O estudo do comportamento mutante em quimiostatos oferece um potencial poderoso meio de estudar os caminhos que são importantes para a regulação taxa de crescimento 14. Usando alto throughput seqüenciamento do código de barras coleções moleculares de milhares de mutantes 15 agora é viável para estes ensaios multiplex permitindo estudos sistemáticos sobre os requisitos genéticos para crescimento em ambientes com limitação de nutrientes. Deve notar-se, no entanto, que uma das limitações da quimióstatos é que eles não abordam o heterogeneidades nas taxas de crescimento de células individuais, que podem ser avaliadas utilizando métodos de microscopia de células individuais 16.
11,17-20 mantém a promessa de compreender a base funcional da evolução adaptativa.
Quimiostatos estão cada vez mais sendo usados em novas áreas de pesquisa, incluindo o estudo da dinâmica de transcrição 21,22 e oscilações metabólicas 23-26. A sua aplicação em ecologia tem se mostrado útil no estudo da dinâmica predador-presa 27. Um renovado interesse na regulação do crescimento de células de mamíferos, e sua deficiência em doenças humanas, pode motivar um retorno ao study de células de mamíferos em quimióstatos utilizando células que podem ser cultivadas em suspensão 28.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo arranque fundos da Universidade de Nova Iorque. Agradecemos Maitreya Dunham e Matt Brauer, que inicialmente desenvolveu o uso de biorreatores Sixfors como quimiostatos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
| Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
| Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
| General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
| Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
| Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
| Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
| Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
| Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
| Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
| Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
| Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
| Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
| Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
| Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
| calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
| sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
| magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
| boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
| copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
| potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
| ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
| manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
| zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
| biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
| calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
| folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
| inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
| niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
| p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
| pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
| riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
| thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
| Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |
References
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