Stimolazione Optogenetic del comportamento in Fuga<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Strumenti optogenetic geneticamente codificati consentono la manipolazione non invasiva dei neuroni specifici del<em> Drosophila</em> Cervello. Tali strumenti in grado di identificare i neuroni la cui attivazione è sufficiente per scatenare o sopprimere comportamenti particolari. Qui vi presentiamo un metodo per l'attivazione Channelrhodopsin2 che si esprime nei neuroni mirate a mosche liberamente a piedi.
Abstract
Un numero crescente di strumenti geneticamente codificati sono sempre a disposizione che permettono la manipolazione non invasiva dell'attività neurale dei neuroni specifici in Drosophila melanogaster 1. Primo fra questi sono strumenti optogenetic, che consentono l'attivazione o silenziamento dei neuroni specifici nel intatta di un animale e muoversi liberamente con la luce brillante. Channelrhodopsin (CHR2) è un fotoattivabile canale cationico che, attivato dalla luce blu, provoca depolarizzazione dei neuroni che lo esprimono. CHR2 è stato efficace per identificare i neuroni critiche per comportamenti specifici, come ad esempio evitare di CO 2, l'estensione proboscide e gigante in fibra di risposte di allarme mediata 2-4. Tuttavia, poiché le sorgenti luminose utilizzate per stimolare CHR2 anche stimolare fotorecettori, queste tecniche optogenetic non sono stati precedentemente utilizzati nel sistema visivo. Qui, uniamo un approccio optogenetic con una mutazione che altera fototrasduzione a demonstrate che l'attivazione di un gruppo di telaio sensibili neuroni nel lobo ottico della mosca, FOMA-1 neuroni, può guidare un comportamento di fuga utilizzato per evitare la collisione. Abbiamo utilizzato un allele nullo di un componente critico della cascata phototransduction, fosfolipasi C-β, codificata dal gene norpA, per rendere l'aria cieco e anche usare la Gal4-UAS sistema attivatore trascrizionale per guidare l'espressione del CHR2 in Foma-1 neuroni. Mosche individuali sono posto su una piccola piattaforma circondata da LED blu. Quando i LED sono illuminati, le mosche rapidamente decollo in volo, in un modo simile a quello visivo guidato telaio-escape comportamento. Riteniamo che questa tecnica può essere facilmente adattato per esaminare altri comportamenti liberi di muoversi in mosche.
Introduction
Un arsenale crescente di strumenti geneticamente codificati sono stati sviluppati per manipolare attività neurale in cellule specifiche in Drosophila melanogaster 1. Questi strumenti consentono l'attivazione non invasiva o silenziamento di neuroni specifici nel intatta di un animale e liberi di muoversi. Tra questi, Channelrhodopsin2 (CHR2), un fotoattivabile canale cationico, offre vantaggi, poiché può essere controllata temporalmente e rapidamente indotta. Quando i neuroni che esprimono CHR2 esposti a brillante blu (470 nm), luce che rapidamente depolarizzare e presentano elevati tassi di cottura 3-5. Tale attivazione mirata dei neuroni specifici negli animali liberi di muoversi ha rivelato la sufficienza dei neuroni particolari per comportamenti come la CO 2 evitamento 3, estensione 2,4 proboscide, e gigante in fibra di startle risposte mediate 4. Tuttavia, poiché le sorgenti luminose intense necessarie per stimolare CHR2 anche stimolare fotorecettori, applicando optecniche togenetic al sistema visivo è stato limitato. Combinando un approccio optogenetic con una mutazione che altera fototrasduzione, abbiamo dimostrato che l'attivazione di uno specifico cluster di neuroni nel lobo ottica della mosca può guidare il comportamento di fuga utilizzata per evitare la collisione 6.
La maggior parte, se non tutti, gli animali visivi presentano un comportamento di fuga per evitare collisioni con oggetti che sopraggiungono. Camminare o stazionario mosche, quando sono presentati con una collisione incombente, decollo in volo, lontano dalla collisione imminente 7-9. I decolli sono caratterizzati da ali alzate prima del decollo e una traiettoria di volo instabile 10,11. Questa risposta è distinto da gigante in fibra di risposta mediata trasalimento, salti che non sono preceduti da ali alzate, e di solito portare a una caduta in caduta libera 4,9. Dopo aver individuato un gruppo specifico di neuroni sensibili telaio nel lobo ottico, Foma-1 neuroni, che sono uniquely sintonizzati per codificare gli oggetti che si avvicinano, abbiamo cercato di sondare il loro coinvolgimento nel comportamento telaio della mosca fuga. Qui mostriamo l'uso di optogenetics per attivare selettivamente questi neuroni, da attuarsi con il comportamento di fuga della mosca.
Usiamo il Gal4-UAS sistema attivatore trascrizionale per guidare l'espressione di CHR2-1 nei neuroni FOMA. CHR2 richiede il cofattore tutto-trans-retinica e come questo si trova in bassi livelli del sistema nervoso centrale Drosophila deve essere integrato nella dieta delle mosche. 3,4 Come luce è utilizzato per attivare CHR2 e vola mostrare comportamenti phototactic forti 12, si è cercato di eliminare la possibilità di una risposta allo stimolo visivo. Per fare questo, abbiamo utilizzato gli animali che erano mutante omozigote per un allele nullo del gene norpA, che codifica per un componente critico della fototrasduzione a cascata, fosfolipasi C-β. Fotorecettori in tali mosche mutanti sono in grado di responsabilitàd alla luce 13. Per testare la stimolazione optogenetic della risposta di fuga, abbiamo bisogno di isolare una sola mosca e fare il bagno in brillante luce blu. Per fare questo, abbiamo posto le mosche singole puntali. Una punta della pipetta è posto in un supporto personalizzato, in modo tale che la mosca si geotactically a piedi fino alla punta e fuori su una piattaforma rettangolare. La mosca è in grado di camminare liberamente sulla parte superiore di questa piattaforma. La piattaforma è circondata da quattro matrici LED blu, contenenti ciascuno 3 LED, focalizzati sulla parte superiore della piattaforma. Dopo la mosca è sulla piattaforma, i LED sono illuminati, e la risposta della mosca è registrati con un telecamera ad alta velocità 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo dimostrato la stimolazione optogenetic di comportamenti di fuga da bagno liberamente a piedi mosche in brillante luce blu. Questo approccio può essere facilmente adattato ad esaminare altri comportamenti nelle mosche liberamente a piedi, e può essere scalata a grandi piattaforme semplicemente le piastrelle array di LED che abbiamo usato su un'area più grande. Utilizzando la telecamera a basso costo descriviamo, o altri sistemi di telecamere disponibili, l'utente può personalizzare il frame rate…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di studio della Stanford Dean (SEJdV), il National Institutes of Pioneer Award Direttore Salute (TRC DP0035350), un premio McKnight Foundation studioso (TRC) e R01 EY022638 (TRC).
Materials
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific & Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼” ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼” NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 |
References
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