रोगी व्युत्पन्न सेल संस्कृति और CD133 का अलगाव<sup> +</sup> मेलेनोमा से ख्यात कैंसर स्टेम सेल
Summary
इस अनुच्छेद के हौसले से प्राप्त प्राथमिक सेल संस्कृतियों, और ट्यूमर कोशिकाओं से एरिथ्रोसाइट्स और fibroblasts की contaminations को दूर करने में मेलेनोमा के ऊतकों की तैयारी का वर्णन करता है. अंत में, हम वर्णन CD133 कैसे<sup> +</sup> ख्यात मेलेनोमा स्टेम कोशिकाओं से हल कर रहे CD133<sup> -</sup> थोक चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस) का उपयोग.
Abstract
उपलब्ध मेलेनोमा आज के लिए बेहतर उपचार विकल्प के बावजूद, उन्नत घातक मेलेनोमा के साथ रोगियों को अब भी प्रगति से मुक्त और समग्र अस्तित्व के लिए एक गरीब पूर्वानुमान है. इसलिए, translational अनुसंधान के लिए घातक मेलेनोमा के लिए लक्षित चिकित्सा में सुधार के लिए आगे आणविक सबूत उपलब्ध कराने की जरूरत है. अतीत में, oncogenic मेलेनोमा के लिए संबंधित तंत्र में बड़े पैमाने पर स्थापित सेल लाइनों में अध्ययन किया गया. अधिक व्यक्तिगत उपचार regimens व्यक्तिगत आनुवंशिक प्रोफाइल के आधार पर करने के लिए रास्ते पर, हम रोगी व्युत्पन्न सेल लाइनों के बजाय सामान्य सेल लाइनों का उपयोग करने का प्रस्ताव है. रोगी का पालन पर विशेष रूप से उच्च गुणवत्ता नैदानिक डेटा, के साथ साथ, इन कोशिकाओं को बेहतर मेलेनोमा प्रगति के पीछे आणविक तंत्र को समझने में सहायक होगा.
यहाँ, हम dissected ताजा ट्यूमर ऊतक से प्राथमिक मेलेनोमा संस्कृतियों की स्थापना की रिपोर्ट. इस क़ीमा और एकल कक्षों में ऊतक के पृथक्करण प्रक्रिया फिर शामिलएरिथ्रोसाइट्स और fibroblasts के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्राथमिक संस्कृति और 'कोशिकाओं मेलेनोमा मूल के विश्वसनीय सत्यापन के साथ contaminations के moval.
हाल की रिपोर्टों से पता चला है कि मेलानोमा, ट्यूमर के बहुमत की तरह, बंदरगाह कैंसर स्टेम कोशिकाओं (सीएससी) है, जो करने के लिए विशेष रूप से ट्यूमर और metastatic राज्य की ओर दीक्षा प्रगति ईंधन लगता है की एक छोटा सा subpopulation. सीएससी पहचान और मेलेनोमा में अलगाव के लिए महत्वपूर्ण मार्करों के CD133 है. प्राथमिक मेलेनोमा संस्कृतियों से CD133 + सीएससी को अलग करने के लिए, हम संशोधित और चुंबकीय सक्रिय सेल (एमएसीएस) Miltenyi से प्रक्रिया छँटाई उच्च छँटाई पवित्रता में जिसके परिणामस्वरूप और CD133 + सीएससी और CD133 की व्यवहार्यता अनुकूलित थोक, जो खेती की जा सकती है और कार्यात्मक विश्लेषण उसके बाद.
Introduction
Cutaneous घातक मेलानोमा त्वचा कैंसर के कम से कम आम है, अभी तक सबसे घातक हैं. एक बढ़ती हुई घटना, दुष्टता और एक तेजी से प्रसार का एक उच्च ग्रेड, घातक त्वचा से संबंधित होने वाली मौतों 1,2 ट्यूमर के 75% के लिए अब मेलानोमा खाते के कारण. प्राथमिक ट्यूमर, कीमोथेरेपी, रेडियोथेरेपी, immunotherapy और संयुक्त chemo और metastasized मेलेनोमा के immunotherapy के सर्जिकल छांटना के अलावा राज्य के कला उपचार मेलेनोमा 3,4 के लिए रणनीतियों रहे हैं. हालांकि, घातक मेलेनोमा chemotherapeutics के लिए एक गरीब प्रतिक्रिया (5-12%) 5,6, और मेलेनोमा BRAF V600E जीन उत्परिवर्तन लाभ उपचार के रूप में नए लक्षित चिकित्सा का वादा से ले जाने के लिए 7 vemurafenib के साथ रोगियों के केवल उन 50-70% के द्वारा होती है समग्र अस्तित्व में सुधार, मेलेनोमा tumorigenesis के तंत्र की एक बेहतर समझ की जरूरत है.
अतीत में, अच्छी तरह से स्थापित वाणिज्यिक में उन तंत्र का अध्ययनखासकर उपलब्ध सेल लाइनों का इस्तेमाल किया गया. कैंसर दीक्षा और प्रगति की आणविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए और अधिक करने के लिए हाल ही में दृष्टिकोण प्राथमिक ट्यूमर ऊतक से सीधे प्राप्त संस्कृतियों का उपयोग एक रणनीति असर कई गुना लाभ: शोधकर्ता रोगी और ऊतक चयन का पूरा नियंत्रण है. नमूना कोशिकाओं expertly चयनित ट्यूमर ऊतक से प्राप्त की है, अपने सभी विषमताओं से ट्यूमर के समान है और रोगी का पालन कर डेटा और एक विस्तृत विकृति संस्कृति की विशेषताओं मूल 8 ट्यूमर के उन लोगों के साथ तुलना करने के लिए अनुमति देते हैं के लिए उपलब्ध है.
इसके विपरीत, कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में प्रासंगिक मॉडल प्रणाली के रूप में स्थापित सेल लाइनों का उपयोग विवादास्पद ढंग से चर्चा की है. पहले से ही 1987 में ओसबोर्न और उनके सहयोगियों ने अलग 9 प्रयोगशालाओं से महत्वपूर्ण जैविक MCF-7 मानव स्तन कैंसर कोशिका लाइनों के बीच मतभेद का वर्णन किया. इस व्यापक जीनोमिक अस्थिरता और परिवर्तन आरएनए अभिव्यक्ति में subculture दौरान सह थाद्वारा Hiorns एट अल nfirmed और सबूत है कि सेल लाइनों संस्कृति में विकसित करते हैं, जिससे मानव 10 कैंसर के मॉडल के रूप में स्थापित संस्कृतियों के प्रत्यक्ष प्रासंगिकता को कमजोर करने के लिए सहायक डेटा प्रदान की.
एक अन्य महत्वपूर्ण विचार है, जो मोटे तौर पर कई वर्षों तक नजरअंदाज कर दिया गया है या असंबंधित 'गलत' कोशिकाओं है, जो पहली बार प्रदर्शन के द्वारा किया गया था पर बीस साल पहले प्रकाश डाला साथ संस्कृतियों के संदूषण अतिवृद्धि का जोखिम यह है कि सेल लाइनों की एक बड़ी संख्या HeLa द्वारा दूषित थे 8,11 कोशिकाओं. 'गलत' सेल लाइनों से डेटा के अशुद्ध अर्थ के लिए हाल ही में साहित्य में फिर से प्रकाश में आया है. डीएनए प्रोफाइलिंग और आणविक कोशिकाजननप्रकरण के संयोजन का उपयोग, MacLeod एट अल. से पता चला है कि कि 252 नए ट्यूमर व्युत्पन्न मानव कोशिका लाइनों के जर्मन सूक्ष्मजीवों और सेल संस्कृतियों (DSMZ) के संग्रह में जमा लगभग 18% intraspecies होना पाया गया या पार interspecies 12,13 contaminants.
इन समस्याओं से बचने के लिए और उपर्युक्त फायदे का उपयोग करना, हम हौसले excised metastases से कम पारित होने मेलेनोमा सेल लाइनों की स्थापना करने का निर्णय लिया.
मजबूत सेल जुदाई और विश्लेषण तकनीकों एकल कोशिका तैयारी जबकि एक साथ सेल और विशेषता सतह प्रोटीन की मौत, विनाश सीमित उत्पन्न करने के लिए आवश्यकता होती है. एकल कोशिका निलंबन में ऊतकों के स्वचालित हदबंदी के लिए एक benchtop साधन gentleMACS Dissociator Miltenyi द्वारा निर्मित है. जब gentleMACS सी ट्यूब्स और अनुकूलित पृथक्करण समाधान, एक बंद व्यवस्था में ट्यूमर ऊतक के एक प्रभावी और कोमल हदबंदी के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया, जबकि प्रतिजन epitopes के संरक्षण और सेल नुकसान को कम करने के हासिल की है. साधन अनुकूलित, विशिष्ट अनुप्रयोगों और मानकीकृत तैयारी guaranties मेलेनोमा ऊतक 14 से एकल कोशिका निलंबन की एक किस्म के लिए पूर्व निर्धारित कार्यक्रम प्रदान करता है.
<पी वर्ग = "jove_content"> हाल ही में पता चला है कि ट्यूमर के बहुमत तथाकथित कैंसर स्टेम कोशिकाओं (सीएससी) है, जो विशेष रूप से ट्यूमर की शुरुआत और क्षमता स्वयं renewing एक्ज़िबिट का एक छोटा सा subpopulation बंदरगाह रिपोर्ट. melanocyte उत्पादन त्वचा की dermis में स्टेम कोशिकाओं की पहचान परिकल्पना के लिए नेतृत्व किया है कि इन कोशिकाओं मेलेनोमा में कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) की उत्पत्ति हो UVA विकिरण के लिए जोखिम के बाद से घातक 15 परिवर्तन के लिए इन कोशिकाओं को प्रधानमंत्री कर सकते हैं हो सकता है. इस तरह के एक आनुवंशिक घाव के परिणाम कोशिकाओं है कि ट्यूमर और स्टेम सेल विशेषताओं का एक संयोजन बंदरगाह होगा.प्रमुख मेलेनोमा में सीएससी की subpopulation का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रस्तावित मार्करों के 16-20 CD133 है. (भी 1 Prominin के रूप में जाना जाता है) CD133, pentaspan transmembrane glycoproteins के एक सदस्य, hematopoietic स्टेम कोशिकाओं, endothelial पूर्वज कोशिकाओं, neuronal और glial स्टेम कोशिकाओं 21-23 में व्यक्त की है. CD133 की अभिव्यक्ति के साथ जोड़ा जाता हैअसममित सेल 24, विभाजन और CD133 के ग्लाइकोसिलेटेड का मिलान करने के लिए सेल 25 भेदभाव पर downregulated होना दिखाया गया था. हाल ही में, CD133 + मेलेनोमा कोशिकाओं आत्म नवीकरण और ट्यूमर दीक्षा 19,20 क्षमता के लिए दिखाया गया है.
CD133 + ख्यात मेलेनोमा सीएससी के समारोह का अध्ययन करने के लिए, हम संशोधित और चुंबकीय सक्रिय सेल प्रणाली (एमएसीएस) Miltenyi बायोटेक से छंटाई करने के लिए CD133 अत्यधिक समृद्ध और व्यवहार्य आबादी + CD133 और प्राप्त करने के लिए अनुकूलित – कोशिकाओं.
चुंबकीय सेल मनका आधारित जुदाई या तो नकारात्मक चयन के लिए अनुमति देता है Matheu एट अल द्वारा दिखाया के रूप में 26 या सकारात्मक चयन के रूप में हम यहाँ दिखाने. सकारात्मक चयन के दौरान विशेष लक्ष्य कोशिका प्रकार, जैसे CD133 व्यक्त कोशिकाओं, चुंबकीय microbeads, 50 एनएम superparamagnetic कणों कि एक के खिलाफ अत्यधिक विशिष्ट एंटीबॉडी संयुग्मित हैं लेबल के साथविशेष सेल सतह प्रतिजन. जुदाई के दौरान, चुंबकीय लेबल की कोशिकाओं के भीतर स्तंभ विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र में बनाए रखा जाता है, जबकि unlabeled कोशिकाओं के माध्यम से प्रवाह. धोने कदम के बाद, स्तंभ विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र से हटा दिया जाता है, और लक्ष्य कोशिकाओं स्तंभ से eluted हैं. लोकसभा या एमएस स्तंभों उच्च शुद्धता के साथ लेबल और unlabeled कोशिकाओं के भागों में सकारात्मक चयन के परिणाम के दौरान प्रयोग किया जाता है. दूसरी ओर, LD कॉलम, नकारात्मक चयन के लिए प्रयोग किया जाता है, लेबल अंश की पवित्रता में थोड़ा कम हो सकता है. उनके मैट्रिक्स की पैकिंग के denser के कारण इन स्तंभों में प्रवाह की दर कम स्तंभ में फंस जा unlabeled कोशिकाओं के एक उच्च जोखिम में जिसके परिणामस्वरूप है. LD कॉलम इसलिए एक अवांछित सेल subpopulation के कड़े कमी के लिए ही किया जाना चाहिए. सकारात्मक चयन microbeads साथ (microbeads के लिए युग्मित एंटीबॉडी) प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष चुंबकीय (लेबलिंग ऊष्मायन द्वारा किया जा सकता है incubatio के बाद प्रदर्शनप्राथमिक एंटीबॉडी के साथ n). विशिष्ट एमएसीएस microbeads प्रोस्टेट या 27 मेलेनोमा की तरह प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं के कई सेल प्रकार के सकारात्मक चयन के लिए उपलब्ध हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
आदेश में ट्यूमर सेल गोली से एरिथ्रोसाइट contaminations को दूर करने के लिए हम अत्यधिक Miltenyi से लाल रक्त सेल समाधान का उपयोग करने की सलाह देते हैं. पारंपरिक Ficoll घनत्व ढाल centrifugation पर एरिथ्रोसाइट्स lysing के लाभ कर रहे हैं कि ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को इस काम का समर्थन और समीक्षकों पांडुलिपि पढ़ने के लिए प्रो. एम. Dietel और डिर्क शूमाकर धन्यवाद.
इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान अभिनव दवाएँ पहल अनुदान समझौते के एन के तहत संयुक्त उपक्रम ° 115234, जो वित्तीय योगदान के यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) और EFPIA कंपनियों में से बना रहे हैं संसाधनों से समर्थन प्राप्त हुआ है तरह योगदान. यह काम भी बर्लिनर Krebsgesellschaft (BKG) के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Reagent | |||
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | |
| Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water | Sigma-Aldrich, Inc. | A2942-50ml | |
| anti-fibroblasts microbeads | Miltenyi Biotec GmbH | 130-050-601 | |
| CD133/1 (W6B3C1) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-395 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich, Inc. | C5138 | |
| DNase I | Applichem GmbH | A3778.0050 | |
| D-PBS without Ca, Mg | PAA Laboratories GmbH | H15-002 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich, Inc. | E-7889 | |
| FBS Superior | Biochrom | S0615 | |
| Indirect CD133 Micro-Bead Kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-895 | Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) | Invitrogen GmbH | 15140-122 | |
| Quantum 263 | PAA Laboratories GmbH | U15-815 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution (10x) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-094-183 | |
| Equipment | |||
| Cell strainer (70 μm) | BD Biosciences | 352350 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-237 | |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-235 | |
| MACS Separator Multi Stand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
| MACS Seperation Columns 25 LS Columns | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-401 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | |
| Natriumchloride | Merck KGaA | 567440-1KG | |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-976 | |
| Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) | Carl Roth GmbH & Co. KG | P668.1 | |
| Steritop-GP Filter Unit 500 ml | Miltenyi Biotec GmbH | SCGPS05RE |
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