زراعة الخلايا المشتقة المريض وعزل CD133<sup> +</sup> خلايا الجذعية السرطانية المزعومين من الميلانوما
Summary
توضح هذه المقالة إعداد الأنسجة التي تم الحصول عليها حديثا في سرطان الجلد الثقافات الخلية الأولية، وكيفية إزالة التلوث من الكريات الحمراء والخلايا الليفية من الخلايا السرطانية. وأخيرا، نحن تصف كيفية CD133<sup> +</supيتم تصنيف> الجذعية خلايا سرطان الجلد المفترضة من CD133<sup> -</sup> معظم المغناطيسي باستخدام الفرز الخلية المنشط (MACS).
Abstract
على الرغم من خيارات العلاج لسرطان الجلد تحسين المتاحة اليوم، المرضى الذين يعانون من سرطان الجلد الخبيث متقدمة لا تزال لديها بسوء التشخيص من أجل البقاء خالية من التقدم والشاملة. ولذلك، والبحث متعدية في حاجة إلى توفير مزيد من الأدلة الجزيئية لتحسين العلاجات المستهدفة لالميلانينية الخبيثة. في الآليات، أنكجنيك الماضية المتعلقة سرطان الجلد وتمت دراسة على نطاق واسع في خطوط الخلايا الراسخة. في الطريق إلى نظم العلاج أكثر تخصيصا على أساس مواصفات جينية الفردية، نقترح استخدام خطوط الخلايا المشتقة من المريض بدلا من خطوط الخلايا عامة. جنبا إلى جنب مع بيانات عالية الجودة السريرية، وخصوصا على المريض المتابعة، فإن هذه الخلايا تكون مفيدة لفهم أفضل للآليات الجزيئية وراء تطور سرطان الجلد.
هنا، ونحن التقرير إنشاء الثقافات سرطان الجلد الأولي من تشريح أنسجة الورم الطازجة. يتضمن هذا الإجراء تنميق وتفكك النسيج إلى خلايا واحدة، وإعادةmoval من التلوث والخلايا الليفية مع كرات الدم الحمراء وكذلك الثقافة الابتدائية والتحقق بصورة موثوق بها من أصل سرطان الجلد الخلايا.
كشفت تقارير حديثة أن الميلانينية، مثل معظم الأورام، الميناء جزء من السكان صغيرة من الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية)، والذي يبدو لتغذية حصرا بدء الورم والتقدم نحو الدولة النقيلي. واحدة من علامات رئيسية لتحديد CSC والعزلة في سرطان الجلد هو CD133. CD133 + لعزل الخلايا الجذعية السرطانية من سرطان الجلد الثقافات الأولية، وقمنا بتعديل الأمثل لفرز الخلايا المغناطيسي المنشط (MACS) الإجراء من Miltenyi مما أدى إلى نقاء عالية والفرز CD133 + صلاحية الخلايا الجذعية السرطانية وCD133 – السائبة، والتي يمكن زراعتها وتحليلها وظيفيا بعد ذلك.
Introduction
الميلانينية الخبيثة الجلدية هي نوع أقل شيوعا، ولكن القاتل من سرطان الجلد الأكثر. نتيجة لتزايد، ودرجة عالية من الخباثة والانتشار السريع، الميلانينية تمثل الآن 75٪ من الأورام الخبيثة الجلد الوفيات المرتبطة 1،2. وبالاضافة الى الاستئصال الجراحي للورم الأولية، والعلاج الكيميائي، العلاج الإشعاعي، العلاج المناعي الكيميائي ومجتمعة والعلاج المناعي للسرطان الجلد انتشر هي الاستراتيجيات للدولة من بين الفن للعلاج سرطان الجلد 3،4. ومع ذلك، يتميز سرطان الجلد الخبيث من ضعف الاستجابة لمبحث المعالجة الكيميائية (5-12٪) 5،6، وتلك فقط 50-70٪ من مرضى سرطان الجلد يحمل الجين V600E BRAF فائدة من طفرة جديدة واعدة لعلاج العلاجات المستهدفة مع 7 لvemurafenib تحسين البقاء على قيد الحياة عموما، هناك حاجة إلى فهم أفضل بكثير لآليات تكون الأورام سرطان الجلد.
لدراسة هذه الآليات في الماضي تسويقية راسخة،واستخدمت خطوط الخلايا المتاحة cially. نهج أكثر حداثة لدراسة الأحداث الجزيئية للسرطان والتقدم بدء استخدام الثقافات الأولية المستمدة مباشرة من أنسجة الورم – وهي فوائد متعددة تحمل استراتيجية: وقد قام الباحث السيطرة الكاملة على المريض واختيار الأنسجة. الخلايا عينات أنسجة الورم المكتسبة من اختيار بخبرة، تشبه الورم مع عدم التجانس في جميع ومتابعة البيانات للمريض والأمراض مفصلة متاح للسماح مقارنة خصائص الثقافة مع تلك الورم الأصلي 8.
في المقابل، ويناقش استخدام خطوط الخلايا على النحو المنصوص عليه في الأنظمة ذات الصلة نموذج أبحاث السرطان للجدل. بالفعل في عام 1987 وصف أوسبورن وزملاء الاختلافات البيولوجية بين كبير MCF-7 خطوط الإنسان خلايا سرطان الثدي من مختبرات مختلفة 9. كان هذا عدم الاستقرار الجيني واسعة والاختلاف في التعبير RNA المشترك خلال ثقافة فرعيةnfirmed من Hiorns وآخرون، وقدمت بيانات داعمة لدليل على أن خطوط الخلايا لم تتطور في الثقافة، مما يضعف أهمية مباشرة لمثل هذه الثقافات التي أنشئت كنماذج لسرطان الإنسان 10.
وهناك اعتبار آخر مهم، التي تم تجاهلها إلى حد كبير على مر السنين، هو خطر التلوث أو فرط نمو الخلايا لا علاقة لها مع الثقافات 'كاذبة'، والتي تم تسليط الضوء الأول على عشرين عاما من خلال إظهار أن كانت ملوثة عدد كبير من خطوط الخلايا بواسطة هيلا الخلايا 8،11. لقد حان سوء تفسير البيانات من 'كاذبة' خطوط الخلايا مؤخرا إلى النور في الأدب مرة أخرى. باستخدام مزيج من التنميط الحمض النووي علم الوراثة الخلوية الجزيئية وكشف ماكلويد وآخرون أن الورم من 252 الجديدة المستمدة من خطوط الخلايا البشرية المودعة لدى مجموعة الألمانية الكائنات الدقيقة والثقافات الخلية (DSMZ)، تم العثور على ما يقرب من 18٪ لتكون إختلافات بين الأنواع أو بين الأنواع عبر 12،13-الملوثات.
لتجنب هذه المشاكل، والاستفادة من المزايا المذكورة أعلاه، قررنا إنشاء المنخفضة مرور خطوط الخلايا سرطان الجلد من الانبثاث رفعه حديثا.
فصل الخلايا قوية وتقنيات التحليل يتطلب أن تكون ولدت وحيدة الخلية مع الحد في الوقت نفسه الاستعدادات موت الخلايا وتدمير البروتينات السطحية مميزة. A صك الفوق للالتفكك الآلي من الأنسجة إلى وحيدة الخلية تعليق هو Dissociator gentleMACS المصنعة من قبل Miltenyi. عندما تستخدم بالاقتران مع gentleMACS C أنابيب والحلول الأمثل التفكك، والتفكك فعالة ورقيقة من نسيج الورم في نظام مغلق ويتحقق مع الحفاظ على الحواتم مستضد والحد من فقدان الخلية. الصك يوفر الأمثل، برامج محددة مسبقا لمجموعة متنوعة من تطبيقات محددة وضمانات موحدة من إعداد وحيدة الخلية تعليق من الأنسجة سرطان الجلد 14.
<ف الطبقة = "jove_content"> كشفت التقارير الأخيرة أن غالبية أورام تؤوي جزء من السكان صغيرة من ما يسمى الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية)، والتي تظهر بشكل حصري للورم والبدء الذاتي تجديد القدرات. أدى تحديد الخلايا الجذعية الخلايا الصباغية التي تنتج في الأدمة من الجلد إلى الفرضية القائلة بأن هذه الخلايا قد يكون منشأ الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية) في سرطان الجلد منذ التعرض للإشعاع UVA يستطيع رئيس هذه الخلايا للتحول الخبيث 15. ونتيجة لهذه الآفة الوراثية تكون الخلايا التي تؤوي مجموعة من الورم وخصائص الخلايا الجذعية.واحدة من علامات الرئيسية المقترحة لتمثيل الخلايا الجذعية السرطانية في حيوانية سرطان الجلد هو CD133 16-20. وأعرب عن CD133 (المعروف أيضا باسم Prominin 1)، وهو عضو في البروتينات السكرية عبر الغشاء pentaspan، في الخلايا الجذعية المكونة للدم، والخلايا البطانية السلف، الخلايا الجذعية العصبية والدبقية 21-23. ويرتبط التعبير عن CD133 معوقد تبين انقسام الخلية غير المتماثلة 24، وحاتمة الغليكوزيلاتي من CD133 أن تكون downregulated على تمايز الخلايا 25. مؤخرا، تم عرض CD133 + خلايا سرطان الجلد أن يكون التجديد الذاتي والقدرة الورم بدء 19،20.
لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية السرطانية CD133 + المفترضة سرطان الجلد، وقمنا بتعديل الأمثل لفرز الخلايا المغناطيسي المنشط (MACS) من نظام التكنولوجيا الحيوية Miltenyi للحصول على السكان وقابلة للحياة عالي التخصيب من CD133 + وCD133 – الخلايا.
الفصل المغناطيسي خلية حبة القائم يسمح لأي اختيار سلبية كما يتضح من ماثيو وآخرون. اختيار 26 أو إيجابية كما نعرض هنا. أثناء اختيار إيجابية هو المسمى مغناطيسيا الخلية المستهدفة خاصة النوع، على سبيل المثال CD133 الخلايا معربا عن، مع، MicroBeads الجسيمات superparamagnetic 50-نانومتر التي هي الأجسام المضادة لمترافق محددة للغاية ضدخاصة مستضد الخلايا السطحية. خلال الفصل، يتم الاحتفاظ الخلايا المسمى مغناطيسيا داخل العمود في المجال المغناطيسي للفاصل، في حين الخلايا غير المسماة تتدفق من خلال. بعد غسل الخطوات، تتم إزالة العمود من المجال المغناطيسي للفاصل، ومزال الخلايا المستهدفة من العمود. وLS أو الأعمدة التي استخدمت خلال MS نتيجة إيجابية في اختيار أجزاء من خلايا وصفت والخالي من الملصقات مع نقاء عالية. من ناحية أخرى، والأعمدة LD، وتستخدم لاختيار سلبية، تؤدي إلى نقاء أقل قليلا من نسبة المسمى. نظرا لكثافة التعبئة من مصفوفة على معدل التدفق في هذه الأعمدة أقل مما أدى إلى ارتفاع خطر الخلايا غير المسماة إلى أن المحاصرين في العمود. ولذلك ينبغي أن تستخدم الأعمدة LD فقط لاستنزاف الصارمة لخلية حيوانية غير المرغوب فيها. لا يمكن أن يؤديها اختيار وضع العلامات الإيجابية التي المغناطيسي المباشر (الضد بالإضافة إلى MicroBeads) أو غير مباشر (مع MicroBeads الحضانة بعد incubatioن مع الأجسام المضادة الأولية). MACS MicroBeads محددة متاحة للاختيار من أنواع الخلايا إيجابية عديدة من الخلايا السرطانية الأولية مثل البروستاتا أو سرطان الجلد 27.
Protocol
Representative Results
Discussion
من أجل إزالة التلوث من كرات الدم الحمراء بيليه الخلايا السرطانية نوصي بشدة باستخدام خلايا الدم الحمراء تحلل من حل Miltenyi. مزايا lysing في الكريات الحمراء خلال الطرد المركزي Ficoll التقليدية التدرج الكثافة هي أنه من أسرع وأبسط. وعلاوة على ذلك، يتم تجنب التلوث مع Ficoll أو خلايا ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أشكر الأستاذ الكتاب M. Dietel وديرك شوماخر لدعم هذا العمل وقراءة نقدية للمخطوطة.
تلقت البحوث التي تؤدي إلى هذه النتائج بدعم من مبادرة مبتكرة التعهد الأدوية المشتركة في إطار اتفاقية المنحة رقم 115234، والموارد التي تتكون من مساهمة مالية من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) والشركات EFPIA 'في مساهمة عينية. كما أيد هذا العمل من قبل Krebsgesellschaft برلين (BKG).
Materials
| Reagent | |||
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | |
| Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water | Sigma-Aldrich, Inc. | A2942-50ml | |
| anti-fibroblasts microbeads | Miltenyi Biotec GmbH | 130-050-601 | |
| CD133/1 (W6B3C1) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-395 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich, Inc. | C5138 | |
| DNase I | Applichem GmbH | A3778.0050 | |
| D-PBS without Ca, Mg | PAA Laboratories GmbH | H15-002 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich, Inc. | E-7889 | |
| FBS Superior | Biochrom | S0615 | |
| Indirect CD133 Micro-Bead Kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-895 | Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) | Invitrogen GmbH | 15140-122 | |
| Quantum 263 | PAA Laboratories GmbH | U15-815 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution (10x) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-094-183 | |
| Equipment | |||
| Cell strainer (70 μm) | BD Biosciences | 352350 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-237 | |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-235 | |
| MACS Separator Multi Stand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
| MACS Seperation Columns 25 LS Columns | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-401 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | |
| Natriumchloride | Merck KGaA | 567440-1KG | |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-976 | |
| Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) | Carl Roth GmbH & Co. KG | P668.1 | |
| Steritop-GP Filter Unit 500 ml | Miltenyi Biotec GmbH | SCGPS05RE |
References
- Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
- Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
- Lens, M. B., Eisen, T. G. Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma. Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).
- Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).
- Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. . Der Onkologe. 16, 1160-1166 (2010).
- Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre. Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).
- Chapman, P. B., et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).
- Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. Breast cancer cell lines: friend or foe. Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).
- Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories. Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).
- Hiorns, L. R., et al. Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture. Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).
- Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. Cross-contamination of cells in culture. Science. 212, 446-452 (1981).
- MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).
- Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).
- Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
- Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Ieta, K., et al. Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer. Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).
- Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).
- Monzani, E., et al. Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential. Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).
- Gedye, C., et al. Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells. Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).
- Kobari, L., et al. CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells. J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).
- Quirici, N., et al. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells. Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).
- Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).
- Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1. J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).
- Florek, M., et al. a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer. Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of Immune Cells from Primary Tumors. J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).
- Mollamohammadi, S., et al. A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).
