Пациент Производные культуре клеток и выделение CD133<sup> +</sup> Предполагаемые раковых стволовых клеток от меланомы
Summary
В данной статье описывается подготовка свежеполученных меланомы ткани в первичных культур клеток, и как удалять загрязнения эритроцитов и фибробластов из опухолевых клеток. Наконец, мы опишем, как CD133<sup> +</sup> Предполагаемые стволовые клетки меланомы сортируются от CD133<sup> -</sup> Массовые с использованием магнитных клеток, активированных Сортировка (MACS).
Abstract
Несмотря на улучшение варианты лечения меланомы, доступных сегодня, пациентов с поздними стадиями меланомы все еще имеют плохой прогноз без прогрессирования и общей выживаемости. Таким образом, трансляционные исследования необходимо представить дополнительные доказательства молекулярного для улучшения таргетной терапии злокачественных меланом. В прошлом онкогенных механизмов, связанных с меланомой были широко изучены в установленном клеточных линий. На пути к более персонализированные схемы лечения с учетом индивидуальных генетических профилей, мы предлагаем использовать пациентом полученных клеточных линий, а общий клеточных линий. Наряду с высоким качеством клинических данных, особенно на пациента наблюдения, эти клетки будут играть важную роль, чтобы лучше понять молекулярные механизмы, лежащие в прогрессии меланомы.
Здесь мы сообщаем о создании первичных культур меланомы от расчлененного свежей ткани опухоли. Эта процедура включает в себя измельчение и диссоциации ткани на отдельные клетки, повторноСнятие загрязнений с эритроцитами и фибробластов, а также первичной культуре и надежной проверки происхождения меланомы клеток.
Последние отчеты показали, что меланома, как и большинство опухолей, гавани небольшой субпопуляции раковых стволовых клеток (ЦОК), который, кажется, исключительно топливо опухоли инициации и прогрессировании к метастатическим государства. Одним из ключевых маркеров для CSC идентификации и выделения в меланомы CD133. Для выделения CD133 + CSCs из первичных культур меланомы, мы изменили и оптимизировать магнитные клеток, активированных Сортировка (MACS) процедуру Miltenyi в результате высокой чистотой сортировки и жизнеспособность CD133 + и CD133 CSCs – объем, который можно выращивать и функционально проанализированы после этого.
Introduction
Кожные злокачественной меланомы является наименее распространенным, но самая опасная форма рака кожи. В связи с ростом заболеваемости, высокой степени злокачественности и быстрое распространение меланомы в настоящее время приходится 75% злокачественных опухолей кожи смертей, связанных с 1,2. Кроме хирургического иссечения первичной опухоли, химиотерапию, лучевую терапию, иммунотерапию и комбинированной химио-и иммунотерапия метастазы меланомы являются государством в самых современных стратегий для лечения меланомы 3,4. Тем не менее, злокачественная меланома характеризуется плохой ответ на химиотерапевтические средства (5-12%) 5,6, и только те 50-70% больных меланомой, несущий ген BRAF V600E мутации выгоду от новых перспективных целевой терапии, как лечение с 7 Для вемурафениб улучшение общей выживаемости, гораздо более глубокое понимание механизмов развития меланомы опухолей необходима.
Для изучения этих механизмов в прошлом, устоявшейся коммерческойбенно доступные клеточные линии были использованы. Более поздние подходы к изучению молекулярных событий начала и прогрессии рака использования первичных культур получены непосредственно из опухолевой ткани – стратегия преимущества подшипников многообразии: исследователь имеет полный контроль над пациентом и тканей выбор. Отобранные клетки получили из искусно выбранных опухолевой ткани, напоминающие опухоли со всеми ее неоднородность и последующие данные пациента и подробные патологии могут позволить характеристики культуры в сравнении с теми из первоначальной опухоли 8.
В противоположность этому, использование установленных клеточных линий в соответствующих модельных систем в исследовании рака обсуждаются спорно. Уже в 1987 году Осборн и коллеги описали значительные биологические различия между MCF-7 линий человека рак молочной железы клетки от различных лабораториях 9. Этот обширный геномной нестабильности и изменения в экспрессии РНК во время субкультуры был одним изnfirmed по Hiorns и соавт., и при условии, поддерживающих данные для доказательства того, что клеточные линии у развиваются в культуре, тем самым ослабив прямое отношение таких культур, как установлено модели человеческого рака 10.
Еще одним важным фактором, который в значительной степени игнорировались на протяжении многих лет, является риск загрязнения или чрезмерного роста культур с несвязанными «ложные» клеток, который был выдвинут более двадцати лет назад, демонстрируя, что большое число клеточных линий были заражены HeLa клетки 8,11. Неверное толкование данных из «ложные» клеточных линий в последнее время вышли на свет в литературе снова. Используя комбинацию ДНК и молекулярной цитогенетики, Маклеод и соавт. Показали, что из 252 новых опухолей полученных клеточных линий человека на хранение в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ), почти 18% были признаны внутривидовой или межвидовой крест -загрязнители 12,13.
Чтобы избежать этих проблем, а также использовать преимущества упоминалось выше, мы решили создать низкой прохождения линии клеток меланомы с метастазами только что вырезали.
Надежная клетка разделения и анализа технологии требуют одноклеточных препаратов, которые будут созданы в то время как одновременно ограничивая клеточной смерти и разрушения характерных поверхностных белков. Настольный инструмент для автоматизированного диссоциации тканей в одной клеточной суспензии является диссоциатор gentleMACS производства Miltenyi. При использовании в сочетании с gentleMACS C Трубы и оптимизированный диссоциации решений, эффективное и нежное диссоциации опухолевой ткани в замкнутой системе достигается при сохранении эпитопов антигена и снижения потери клеток. Прибор предлагает оптимизировать, предустановленных программ для различных конкретных приложений и стандартизированных гарантий подготовки одноклеточных суспензий от меланомы ткани 14.
<р = класса "jove_content"> Последние отчеты показали, что большинство опухолей питать небольшой субпопуляции так называемые раковые стволовые клетки (ЦОК), которые обладают исключительно опухоли инициирование и самообновлению мощности. Идентификация меланоцитов производству стволовых клеток в дерму кожи привело к гипотезе, что эти клетки могут быть происхождении раковых стволовых клеток (ЦОК) в меланомы, поскольку воздействие радиации UVA можете прокачать эти клетки для злокачественной трансформации 15. В результате таких генетических поражений было бы клеток, которые питают сочетание опухоли и характеристики стволовых клеток.Одним из ключевых маркеров предложили представлять субпопуляции CSCs в меланомы CD133 16-20. CD133 (также известный как Prominin 1), членом pentaspan трансмембранного гликопротеина, выражается в гемопоэтических стволовых клетках, эндотелиальных клеток-предшественников, нейронов и глиальных клеток стволовые 21-23. Экспрессия CD133 коррелирует сасимметричное деление клетки 24, и гликозилированного эпитоп CD133 было показано, что подавляется на клеточную дифференцировку 25. Недавно CD133 + клеток меланомы было показано, что самообновлению и опухоль начала мощностью 19,20.
Для изучения функций CD133 + предполагаемый меланомы CSCs, мы изменили и оптимизировать магнитные клеток, активированных Сортировка (MACS) системы от Miltenyi Biotech для получения обогащенного и жизнеспособных популяций CD133 и CD133 + – клетки.
Магнитный шарик на основе разделения клеток позволяет либо отрицательное выделение, как показано на Мэтью и др. 26. Или положительный выбор, как мы показываем здесь. Во время положительного отбора определенного типа клеток-мишеней, например, CD133 экспрессирующие клетки, магнитно меченных микросфер, 50-нм суперпарамагнитных частиц, которые сопряжены с весьма специфических антител противспецифический антиген клеточной поверхности. Во время разделения, магнитно-меченых клеток сохраняется в столбце в магнитном поле сепаратора, в то время как немеченого клетки течь через. После промывки, столбец удаляется от магнитного поля сепаратора, и клетки-мишени вымываются из колонки. LS или MS столбцы, используемые при положительном результате отбора в доли меченых и немеченых клеток с высокой степенью чистоты. С другой стороны, LD столбцы, используемые для негативного отбора, в результате несколько ниже, чистота меченые фракции. В связи с плотной упаковкой их матрицы скорость потока в этих колонках ниже, что приводит к высокому риску немеченого клетки в ловушке в столбце. LD столбцов поэтому его следует использовать только для строгих истощения нежелательных субпопуляции клеток. Положительный отбор может осуществляться прямые (антитела связаны с микрошарики) или косвенным магнитной маркировки (инкубация с микрошарики после incubatioп с первичными антителами). Конкретные микрошарики MACS доступны для позитивной селекции многочисленных типов клеток из первичной опухоли клетки простаты или, как меланома 27.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для того, чтобы удалить загрязнения из эритроцитов опухолевых клеток гранулы мы настоятельно рекомендуем использовать красные клетки крови лизисом решение от Miltenyi. Преимущества лизиса эритроцитов по сравнению с традиционными центрифугирования в градиенте плотности Ficoll в том, что эт…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят профессора М. Dietel и Дирк Шумахер за поддержку этой работы и критически чтении рукописи.
Научных исследований, ведущих к этим результатам, получила поддержку со стороны Инновационные инициативы лекарственных средств совместного проекта по гранту соглашения N ° 115234, ресурсы, которые состоят из финансового вклада Седьмой рамочной Европейского Союза, Программы (FP7/2007-2013) и EFPIA компаний в вид вклада. Эта работа также была поддержана Berliner Krebsgesellschaft (BKG).
Materials
| Reagent | |||
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | |
| Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water | Sigma-Aldrich, Inc. | A2942-50ml | |
| anti-fibroblasts microbeads | Miltenyi Biotec GmbH | 130-050-601 | |
| CD133/1 (W6B3C1) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-395 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich, Inc. | C5138 | |
| DNase I | Applichem GmbH | A3778.0050 | |
| D-PBS without Ca, Mg | PAA Laboratories GmbH | H15-002 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich, Inc. | E-7889 | |
| FBS Superior | Biochrom | S0615 | |
| Indirect CD133 Micro-Bead Kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-895 | Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) | Invitrogen GmbH | 15140-122 | |
| Quantum 263 | PAA Laboratories GmbH | U15-815 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution (10x) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-094-183 | |
| Equipment | |||
| Cell strainer (70 μm) | BD Biosciences | 352350 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-237 | |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-235 | |
| MACS Separator Multi Stand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
| MACS Seperation Columns 25 LS Columns | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-401 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | |
| Natriumchloride | Merck KGaA | 567440-1KG | |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-976 | |
| Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) | Carl Roth GmbH & Co. KG | P668.1 | |
| Steritop-GP Filter Unit 500 ml | Miltenyi Biotec GmbH | SCGPS05RE |
References
- Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
- Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
- Lens, M. B., Eisen, T. G. Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma. Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).
- Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).
- Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. . Der Onkologe. 16, 1160-1166 (2010).
- Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre. Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).
- Chapman, P. B., et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).
- Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. Breast cancer cell lines: friend or foe. Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).
- Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories. Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).
- Hiorns, L. R., et al. Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture. Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).
- Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. Cross-contamination of cells in culture. Science. 212, 446-452 (1981).
- MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).
- Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).
- Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
- Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Ieta, K., et al. Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer. Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).
- Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).
- Monzani, E., et al. Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential. Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).
- Gedye, C., et al. Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells. Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).
- Kobari, L., et al. CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells. J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).
- Quirici, N., et al. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells. Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).
- Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).
- Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1. J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).
- Florek, M., et al. a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer. Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of Immune Cells from Primary Tumors. J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).
- Mollamohammadi, S., et al. A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).
