استخدام البروتين عكس صالحة المرحلة (RPPA) لاستكشاف البروتين في التعبير التغير فردية سرطان الخلايا الكلوية
Summary
RPPA تمكن من التعبير البروتين مئات العينات، وطبع على الشرائح النيتروسليلوز لاستجوابه في وقت واحد، وذلك باستخدام الأجسام المضادة fluorescently المسمى. وقد تم تطبيق هذه التقنية لدراسة تأثير عدم التجانس العلاج من تعاطي المخدرات داخل الخلايا الكلوية سرطان واضحة.
Abstract
حاليا لا يوجد علاج العلاجية لسرطان الخلايا المتنقل الخلايا الكلوية واضحة، أشيع البديل من هذا المرض. ويعتقد أن العامل الرئيسي في هذه المقاومة العلاج ليكون التعقيد الجزيئي للمرض 1. وقد تم استخدام العلاج الموجه مثل مثبط التيروزين كيناز (TKI)-sunitinib، ولكن فقط 40٪ من المرضى سوف تستجيب، والغالبية العظمى من هؤلاء المرضى الانتكاس بعد 1 2 سنة. على هذا النحو مسألة المقاومة الذاتية والمكتسبة في مرضى السرطان الكلوي الخليوي هي وثيقة الصلة 3.
من أجل دراسة مقاومة TKIs، مع الهدف النهائي المتمثل في تطوير فعالية وعلاجات شخصية، مطلوب الأنسجة متتابعة بعد فترة محددة من العلاج المستهدف، وهو نهج قد أثبتت نجاحها في 4 سرطان الدم النخاعي المزمن. لكن معقد تطبيق مثل هذه الاستراتيجية في سرطان الخلايا الكلوية من مستوى عال من بعدم التجانس بين أوراسكوم تليكوم القابضة وintratumoral، الذي هو سمة من سمات سرطان الخلايا الكلوية 5،6 وكذلك الأورام الصلبة الأخرى 7. راسخة عدم التجانس Intertumoral بسبب الخلافات transcriptomic والجينية حتى في المرضى الذين يعانون من عرض مماثل، ومرحلة الصف من الورم. وبالإضافة إلى ذلك فإنه من الواضح أن هناك شيء عظيم المورفولوجية (intratumoral) عدم التجانس في RCC، التي من المرجح أن تمثل عدم التجانس الجزيئية أكبر. رسم خرائط تفصيلية وتصنيف الأورام من قبل مجلس قيادة الثورة التحليل الصرفي والدرجات المجمعة فورمان يسمح للاختيار المناطق ممثل للتحليل البروتين.
تحليل البروتين على أساس من RCC 8 هو جذابة نظرا لتوفر على نطاق واسع في مختبرات علم الأمراض، إلا أن تطبيقها يمكن أن يكون مشكلة بسبب محدودية توافر الأجسام المضادة المحددة 9. ونظرا لطبيعة طخة نقطة صالحة للبروتين عكس المرحلة (RPPA)، والنوعية الأجسام المضادة يجب أن به قبل التحقق من صحة، على هذا النحو رقابة صارمة على الجودة من الأجسام المضادة المستخدمة هي ذات أهمية قصوى. على الرغم من هذا القيد الشكل طخة نقطة لا تسمح التصغير الفحص، مما يسمح لطباعة مئات العينات على شريحة واحدة النيتروسليلوز. ويمكن بعد ذلك يتم تحليل الشرائح المطبوعة بطريقة مماثلة لتحليل الغربية مع استخدام الأجسام المضادة المحددة الهدف الرئيسي والأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى، والسماح لمضاعفة. ويمكن بعد ذلك الفرق التعبير البروتين في عينات جميع على شريحة يتم تحليلها في وقت واحد من خلال مقارنة المستوى النسبي للمضان بطريقة أكثر فعالية من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة RPPA المقدمة هنا يمثل بديلا إنتاجية عالية لأسلوب الإنتاجية لطخة غربية تستخدم على نطاق واسع ولكن منخفضة نسبيا للتحليل البروتين. الأسلوب يسمح مئات العينات لتكون شبه كمي تحليل ومقارنة السماح في نفس الوقت للمقارنة المباشرة من البروتينات الرئيسية في مجموعة واسعة من…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يذكر المصنف من المؤلفين وزارة الخارجية، DF، JN، DJH وGDS أعلاه يتم تمويله من قبل مكتب كبير العلماء، ومنحة رقم: ETM37 وبدعم من معهد أبحاث السرطان في المملكة المتحدة مركز الطب التجريبي للسرطان. ويتم تمويل عمل AL من قبل الكلية الملكية للجراحين في ادنبره روبرتسون الاستئماني، صندوق ميلفيل لرعاية وعلاج من السرطان ومجلس البحوث الطبية. ويدعم IO من قبل الجمعية الملكية للزمالة ادنبره الاسكتلندية cofunded الحكومة باتخاذ إجراءات ماري كوري والطبية UK مجلس البحوث. فإن الكتاب أود أن أشكر SCOTRRCC شارك في المتقدمين والمتعاونين لمناقشاتهم المفيدة حول بعض الموضوعات التي تمت مناقشتها في هذه الورقة.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| aprotinin | Sigma | A6279 |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | |
| FastFrame’ four bay slide holder | Whatman | 10486001 |
| FAST Slide – 2-Pad | Whatman | 10485317 |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
- Stewart, G. D., O’Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
- Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).
- Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets. Genome Med. 2, 52 (2010).
- Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 110, 4005-4011 (2007).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
- Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma. Front. Oncol. 2, 49 (2012).
- Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
- O’Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma. PLoS One. 7, e31557 (2012).
- Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).
- Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. Non-parametric quantification of protein lysate arrays. Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).
- Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions. Proteome Sci. 9, 53 (2011).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).
