Bruk av omvendt fase Protein Arrays (RPPA) til Explore Protein Expression Variasjon innen Individuelle nyre celle kreft
Summary
RPPA muliggjør protein uttrykk for hundrevis av prøver, trykt på nitrocellulose lysbilder å bli avhørt samtidig, ved hjelp av fluorescensmerkede antistoffer. Denne teknikken har blitt anvendt for å studere effekten av medikamentbehandling heterogenitet innenfor klarcellet nyrekarsinom.
Abstract
Foreløpig er det ingen kurativ behandling for metastatisk klarcellet nyrecellekreft, den vanligste varianten av sykdommen. En nøkkelfaktor i denne behandlingen resistens er antatt å være den molekylære kompleksitet sykdom 1. Målrettet terapi som tyrosinkinasehemmer (TKI)-sunitinib har blitt utnyttet, men bare 40% av pasientene vil reagere, med overveldende flertall av disse pasientene fikk tilbakefall innen ett år 2. Som sådan spørsmålet om egenverdi og ervervet resistens i nyre celle kreftpasienter er svært relevant 3.
For å studere motstand mot TKIs, med det endelige mål om å utvikle effektive, personlige behandlinger, sekvensiell vev etter en bestemt periode målrettet terapi nødvendig, en tilnærming som hadde vist seg vellykket i kronisk myelogen leukemi 4. Men anvendelsen av en slik strategi i nyrecellekarsinom kompliseres av det høye nivået av bOTH inter-og intratumoral heterogenitet, som er et trekk av nyrecellekarsinom 5,6 samt andre solide tumorer 7. Intertumoral heterogenitet grunn transcriptomic og genetiske forskjeller er godt etablert, selv hos pasienter med lignende presentasjon, scene og grad av tumor. I tillegg er det klart at det er stor morfologiske (intratumoral) heterogenitet i RCC, som er sannsynlig å representere enda større molekylær heterogenitet. Detaljert kartlegging og kategorisering av RCC svulster ved kombinert morfologisk analyse og Fuhrman gradering tillater valg av representative områder for proteomikk analyser.
Protein analyse av RCC 8 er attraktiv på grunn av sin utbredte tilgjengeligheten i patologi laboratorier, men kan sin søknad være problematisk på grunn av den begrensede tilgjengeligheten av spesifikke antistoffer 9. På grunn av dot blot natur omvendt fase Protein Arrays (RPPA), antistoffspesifisitet må be pre-validert, slik streng kvalitetskontroll av antistoffer som brukes er av overordnet betydning. Til tross for denne begrensningen dot blot format tillater analysen miniatyrisering, noe som åpner for utskrift av hundrevis av prøver på et enkelt nitrocellulose lysbilde. Trykte lysbilder kan deretter bli analysert på en lignende måte til Western analyse med bruk av target spesifikke primære antistoffer og fluorescensmerkede sekundære antistoffer, slik at for multipleksing. Differensiell proteinekspresjon tvers av alle prøvene på et lysbilde kan da bli analysert samtidig ved å sammenligne den relative nivået av fluorescens på en mer kostnadseffektiv og high-throughput måte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den RPPA metoden presentert her representerer en høy gjennomstrømning alternativ til den mye brukte men relativt lav gjennomstrømming Western blot teknikk av protein analyse. Fremgangsmåten tillater hundrevis av prøver for å være semi-kvantitativt analysert og sammenlignet samtidig muliggjør direkte sammenligning av sentrale proteiner over et bredt utvalg av cellelinjer og vevsprøver. Multipleksing med forskjellige antistoff arter øker ytterligere effekten av teknikken slik at flere antistoffer som skal brukes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet med forfatterne FCO, DF, JN, DJH og GDS nevnt ovenfor er finansiert av Chief Scientist Office, prosjekt nummer: ETM37 og støttes av Cancer Research UK Experimental Cancer Medicine Centre. Arbeidet med AL er finansiert av Royal College of Surgeons i Edinburgh Robertson Trust, Melville Trust for omsorg og helbredelse av kreft og Medical Research Council. IO er støttet av en Royal Society of Edinburgh skotske regjeringen Fellowship cofunded av Marie Curie Actions og Storbritannia Medical Research Council. Forfatterne ønsker å takke SCOTRRCC co-søkere og samarbeidspartnere for deres nyttige diskusjoner om noen av temaene i denne artikkelen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| aprotinin | Sigma | A6279 |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | |
| FastFrame’ four bay slide holder | Whatman | 10486001 |
| FAST Slide – 2-Pad | Whatman | 10485317 |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
- Stewart, G. D., O’Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
- Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).
- Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets. Genome Med. 2, 52 (2010).
- Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 110, 4005-4011 (2007).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
- Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma. Front. Oncol. 2, 49 (2012).
- Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
- O’Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma. PLoS One. 7, e31557 (2012).
- Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).
- Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. Non-parametric quantification of protein lysate arrays. Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).
- Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions. Proteome Sci. 9, 53 (2011).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).
