Быстрое колориметрических тестов на качественно Различают РНК и ДНК в биомолекулярных образцов

Summary

Набор колориметрических тестов описан быстро отличительной белков, РНК, ДНК, и вновь ducing сахара в потенциально гетерогенных образцов биомолекул.

Abstract

Биохимические эксперименты как правило, требует точного знания, на ранней стадии, в состав нуклеиновых кислот, белков и других компонентов биомолекулярной в потенциально гетерогенных образцов. Нуклеиновые кислоты могут быть обнаружены через несколько устоявшиеся подходы, включая аналитические методы, которые спектрофотометрического (например, _260), флуорометрической (например, связывания флуоресцентных красителей), или колориметрическим (нуклеозид конкретных хромогенных химических реакций). ¹ Хотя это не легко отличить РНК от ДНК, ₂₆₀ / A ₂₈₀ отношение обычно используется, так как она предлагает простой и быстрый ² Оценка относительного содержания нуклеиновых кислот, которые поглощают преимущественно вблизи 260 нм и протеина, который поглощает в основном вблизи 280 нм. Коэффициенты <0,8 принимаются как показатель «чистые» образцы белка, в то время как чистая нуклеиновой кислоты (NA) характеризуется отношение> 1,5 ^3.

HoWever, существуют сценарии, в которых белок / NA содержание не может быть столь же четко и надежно вывести из простого UV-VIS спектрофотометрического измерения. Например, (я) образцы могут содержать один или несколько белков, которые являются относительно лишенной ароматические аминокислоты отвечают за поглощение при ≈ 280 нм (Trp, Tyr, Phe), как и в случае с некоторыми малыми РНК-связывающие белки, и (II), образцы могут проявлять промежуточные A ₂₆₀ / A ₂₈₀ соотношения (~ 0.8 <~ 1.5), где белок / NA содержание гораздо менее ясен и даже может отражать некоторые высоким сродством связь между белком и Н. А. компонентов. Для такого сценария, мы опишем здесь набор колориметрические анализы быстро отличать РНК, ДНК, и снижение сахара в потенциально смешанного образца биомолекул. Методы опираются на различную чувствительность пентоз и других углеводов, чтобы Бенедикта, Bial (в орцинола), и Дише (в дифениламина) реагентов; обтекаемой протоколов может быть комзавершена в течение нескольких минут, без каких-либо дополнительных шагов от того, чтобы изолировать компоненты. Анализы могут выполняться параллельно проводить различие между ДНК и РНК, а также указывают на наличие свободных редуцирующих сахаров, таких как глюкоза, фруктоза, рибоза и (рис. 1).

Introduction

Большая часть клеточной биологии происходит через молекулярные взаимодействия с участием ДНК и РНК. ⁴ Эти естественные нуклеиновых кислот (НО) взаимодействуют друг с другом, ⁵ с белками, ⁶ и с множеством малых молекул соединений и лигандов в естественных условиях (например, двухвалентных катионов ^7). Взаимодействия могут быть кратко-или долгосрочных (кинетически), могут варьироваться от умеренных до высоких к низким сродством (термодинамические силы), а также может обладать существенным изменением химических свойств и специфики – некоторые ассоциации являются достаточно специфическими (например, ДНК · · факторы транскрипции, РНК · · · факторы сплайсинга), в то время как другие взаимодействия обязательно являются гораздо более общие (например, ДНК · · · бактериальный гистона-подобных белков HU ^8). Non-специфическими взаимодействиями с НСБУ может иметь практические последствия для лабораторного эксперимента с участием смесей biomolecules, как это возможно, и даже вероятно, что некоторые ВПЛ будут ассоциировать с биомолекул интерес, по крайней мере в некоторое подмножество экспериментальных условиях используются (ионной силы, рН раствора и т.д.).

Рассмотрим, например, производство белка интереса (POI) через гетерологичных чрезмерной экспрессии рекомбинантных белков в Escherichia культуре клеток кишечной; такая процедура обычно выполняется практически в любой лаборатории структурной биологии ⁹ В подготовкой для дальнейших экспериментов, например. как биохимическая / биофизических характеристик, кристаллизация, и т.д.., первоначальные усилия правило, сосредоточены на получении достаточного количества POI в качестве чистой, по возможности, идеально, как химически однородной и биофизически монодисперсных образцов. После разрушения клеток-хозяев, на ранних стадиях типичный рабочий процесс очистки стремиться изолировать POI из E. палочки белков, нуклеиновых кислот, мусор клеточной стенки,и другие компоненты клеточных лизатов. Тем не менее, хозяин NAS может совместно очищают с POI в течение нескольких физико-химических причин – очень основной POI могут неспецифически выпадающего хозяин ДНК / РНК; POI могут иметь общие NA-связывающей активности (например, вышеупомянутый HU); POI может быть достаточно конкретным NA-связывающего белка, но экспонат перекрестной реактивности с принимающей РНК или ДНК, принимающих NAS может взаимодействовать с матрицей хроматографии и тем самым просто совместно элюируются с POI, и так далее. Неизбирательное, высокое сродство связывания хозяин NAs к POI могут представлять неприятная проблема, потому что НС примесей, скорее всего, мешают вниз по течению экспериментов (например, анализы флуоресценции анизотропии POI • связывание РНК ^10). Кроме того, непредвиденные POI · · · НС ассоциации также могут быть просмотрены случайно, так как такое взаимодействие освещения нуклеиновой кислоты связывающей способности POI автора. В любом случае, независимо от того НАН Украины являются ключевыми компонентами или загрязняющих веществ, нужно сначала количественно иопределить тип (ДНК, РНК) совместной очистки НАН Украины в подготовке к вниз по течению экспериментов.

Некоторые аналитические методы для обнаружения и количественного НАН Украины в образце. Большинство из доступных методов принципиально либо спектрофотометрический (например, A ₂₆₀ значения абсорбции и ₂₆₀ / A ₂₈₀ коэффициентов), флуорометрической (например, связывание тиазола оранжевого или других флуоресцентных красителей НС), или колориметрическим (восприимчивость нуклеозидов в химических реакциях что выход хромофоров поглощающие в УФ-VIS области электромагнитного спектра), а недавно описаны де Мей и др. ^1. Тем не менее, важным шагом в определении типа полинуклеотид как РНК или ДНК, выходят за рамки многих из этих количественного подходы. Здесь мы предлагаем набор колориметрических тестов для быстрого выявления типов компонентов НС в белковой образца.

Протоколов, описанных здесь сбыть эффективно выполнены без дополнительных мер изоляции потенциальных примесей NA, и полагаться на анализ Бенедикта для снижения сахара ^11, орцинола анализа для пентоз ^12,13 и ^14,15 реакции дифениламина 2'-deoxypentoses (рис. 1 и 2) . Тест Бенедикт (рис. 2а) использует способность линейной, открытой цепью (альдегид) форма альдозы сахара снизить Cu ^{2 +,} с сопутствующей окисление карбонильных сахара в карбоксилат фрагмент и производства Cu ₂ O в качестве нерастворимого красного осадка. Эта реакция будет положительной реакцией с бесплатным снижения сахара, такие как альдоз и кетоз (которые преобразуют в соответствующие альдоз через enediol промежуточные продукты), но не с пентозы сахара, которые зафиксированы в циклической форме, как часть ковалентной основу ДНК или РНК полинуклеотида. В связи с минималистичным требование свободного полуацеталь функциональность, другие сотрудничествеmpounds, которые могли бы положительный результат в этом тесте – и, следовательно, выступать в качестве потенциальных мешающих – включают α-гидрокси-кетоны и коротких олигосахаридов (например, дисахарид мальтозу). И Bial в орцинола (рис. 2б) и Дише в дифениламина (рис. 2, в) реакции основаны на начальном разрушение полинуклеотида позвоночника, через депуринизации нуклеозида и дальнейшего кислоты или основания катализируемого гидролиза родителей нуклеотида, с получением фуран-2 -карбальдегида (фурфурол) производные; эти производные затем реагировать либо с полигидрокси фенола, такие как орцинола (Bial) или дифениламина (Дише автора) реагентами с образованием окрашенных продуктов конденсации в значительной степени неизвестной химической структуры. ДНК по сравнению с РНК специфика анализа Дише проистекает из того факта, что пентозы сахара должно быть 2'-венозная для того, чтобы быть восприимчивым к окислению ω-hydroxylevulinyl альдегид, который далее реагирует с дифениламинав кислых условиях с получением ярко-синий конденсата (рис. 2). Использование обтекаемой протоколов, описанных здесь, мы обнаружили, что эти сахара конкретных колориметрических реакций могут дифференцироваться между РНК и ДНК, а также будет свидетельствовать о наличии свободных редуцирующих сахаров, таких как глюкоза, фруктоза, рибоза или в молекулярно-биологических образцов.

Protocol

1. Бенедикт анализа для редуцирующих сахаров Подготовить соответствующее количество реагентов Бенедикта – 940 мм безводного карбоната натрия, 588 мМ цитрат натрия дигидрат, 68 мм меди (II) сульфата пентагидрата. Этот реагент можно хранить при комнатной температуре (RT) в течение по край?…

Representative Results

Результаты представлены на рисунке 3 для применения этих колориметрических тестов с известными соединениями ссылки. Представитель качественные данные приведены для (а), Бенедикт Bial в орцинола (б) и Дише в дифениламина (C) анализы, и стандартные кривые для этих трех анализов пок?…

Discussion

Колориметрических тестов, представленные здесь предлагают простой подход к быстрой оценки химической природы биомолекулярных смесей, таких как встречаются при очистке белков, РНК или комплексы из цельного клеточный лизат в подготовке для дальнейших исследований. Как структурной…

Materials

Reagent or equipment	Supplier/company	Catalog number	Comments, notes
Anhydrous sodium carbonate	Fisher Scientific	S263
Sodium citrate dihydrate	Sigma	S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate	VWR	VW3312-2
Orcinol monohydrate	Sigma-Aldrich	O1875
Concentrated HCl	VWR	BDH3030
Ferric chloride hexahydrate	Sigma	F-2877
Diphenylamine	Aldrich	112763
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A28
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	258105
Ethanol	Koptec	V1101
Ribose	Sigma	R-7500	prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker’s yeast (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus	Sigma	D1501	prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C
			Reagents, Equipment & Safety Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.