Electrotaxis microfluidica-based per On-demand analisi quantitativa della<em> Caenorhabditis elegans</em> 'Locomotion
Summary
Un metodo di micro-elettro-fluidico semiautomatico per indurre on-demand locomozione in<em> Caenorhabditis elegans</em> È descritto. Questo metodo si basa sul fenomeno neurofisiologico di vermi che rispondono a campi elettrici lievi ("electrotaxis") all'interno di canali microfluidica. Microfluidica electrotaxis serve come una tecnica rapida, sensibile, a basso costo, e scalabile per lo screening per i fattori che incidono sulla salute neuronale.
Abstract
Le nematode Caenorhabditis elegans è un organismo modello versatile per la ricerca biomedica causa della sua conservazione dei geni correlati alla malattia e percorsi così come la sua facilità di coltivazione. Diversi C. modelli di malattia elegans sono state riportate, comprese malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson (PD), che comporta la degenerazione dopaminergica (DA) neuroni 1. Entrambi i transgeni e prodotti chimici neurotossici sono stati utilizzati per indurre DA neurodegenerazione e conseguenti difetti di movimento a Worms, consentendo indagini sulla base della neurodegenerazione e schermi per i geni neuroprotettivi e composti 2,3.
Schermi in eucarioti inferiori come C. elegans forniscono un mezzo efficace ed economico per identificare i composti ed i geni che influenzano la segnalazione neuronali. Schermi tradizionali sono in genere eseguita manualmente e ha ottenuto mediante ispezione visiva, di conseguenza, essi sono ora-consUming e soggetto a errori umani. Inoltre, la maggior attenzione per l'analisi livello cellulare, ignorando locomozione, che è un parametro particolarmente importante per i disturbi del movimento.
Abbiamo sviluppato un sistema di screening microfluidica romanzo (Figura 1) che controlla e quantifica C. locomozione elegans 'utilizzando stimoli di campo elettrico all'interno di microcanali. Abbiamo dimostrato che un campo di corrente continua (DC) può indurre robustamente on-demand locomozione verso il catodo ("electrotaxis") 4. Inversione di polarità del campo fa sì che il verme di invertire rapidamente la sua direzione. Abbiamo anche dimostrato che i difetti nei neuroni sensoriali dopaminergici e altri alterano la risposta nuoto 5. Pertanto, anomalie nella segnalazione neuronali possono essere determinate utilizzando locomozione come read-out. La risposta movimento può essere quantificato con precisione utilizzando una serie di parametri quali la velocità di nuoto, corpo frequenza flessione e tempo di inversione.
<p class = "jove_content"> Il nostro lavoro ha rivelato che la risposta electrotactic varia con l'età. In particolare, i giovani adulti rispondono ad una gamma più bassa di campi elettrici e di muoversi più velocemente rispetto alle larve di 4. Questi risultati ci hanno portato a progettare un nuovo dispositivo microfluidica per ordinare passivamente vermi per età e fenotipo 6.Abbiamo anche testato la risposta dei vermi a impulsi DC e alternata (AC), campi elettrici di corrente. Campi DC pulsate di vari cicli di lavoro effettivamente electrotaxis generati sia in C. elegans e il suo cugino C. briggsae 7. In un altro esperimento, simmetriche campi AC con frequenze che vanno da 1 Hz a 3 KHz immobilizzate vermi all'interno del canale 8.
Realizzazione del campo elettrico in un ambiente microfluidica consente l'esecuzione rapida e automatizzata del test electrotaxis. Questo approccio promette di facilitare schermi genetiche e chimiche ad alto throughput per i fattoriche interessano la funzione neuronale e vitalità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sfruttando il fenomeno comportamentale prima descritto da Gabel e colleghi e di costruzione sul dielettroforetica lavoro manipolazione di Chuang e colleghi 11,12, il nostro saggio electrotaxis microfluidica basata fornisce un metodo semplice, robusto e sensibile per sondare l'attività neuronale in vermi che utilizzano il movimento come un'uscita. L'analisi dei parametri di movimento permette confronto quantitativo tra diversi genotipi. La precisione di fabbricazione e di applicazione microcanale …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada, Canada Research Chairs Program Canadian Institutes of Health Research, e Ontario Ministero della ricerca e dell'innovazione attraverso i loro primi ricercatori Programma Award per il sostegno finanziario.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92×16 mm Petri dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
| Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
| Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
| Hot plate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
References
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
- Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
- Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , (2013).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116 (2011).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702 (2010).
- van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027 (2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
- Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
- Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -. M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5 (2005).
- Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -. M. D. i., Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637 (2011).
