Summary
نحن هنا وصف اختبار تفضيل ضوء الظلام ليرقة ذبابة الفاكهة. ويوفر هذا الاختبار معلومات حول تنظيم الساعة البيولوجية الفطرية والضوء photobehavior الاستشعار عن بعد ومعالجة.
Abstract
أعمال خفيفة مثل إشارة البيئية للتحكم في سلوك الحيوان على مختلف المستويات. ويستخدم الجهاز العصبي اليرقات ذبابة الفاكهة كنموذج فريد للإجابة على الأسئلة الأساسية حول كيفية معالجة المعلومات الخفيفة ومشتركة بين السلوكيات السريع والإيقاعية. يرقات ذبابة الفاكهة عرض سلوك التهرب النمطية عند تعرضها للضوء. للتحقيق في التصرفات تعتمد على الضوء ويمكن تطبيق اختبارات بسيطة نسبيا تفضيل ضوء الظلام. في الفقاريات والمفصليات المسارات العصبية المشاركة في الاستشعار عن بعد ومعالجة المدخلات البصرية تتداخل جزئيا مع تلك معالجة المعلومات الإيقاعية ضوئي. مسألة رائعة لكيفية عمل نظام الاستشعار ضوء ونظام الساعة البيولوجية التفاعل للحفاظ على النواتج السلوكية تنسيق يبقى غير مستكشفة إلى حد كبير. ذبابة الفاكهة هو نموذج التأثير البيولوجي لنهج هذه الأسئلة، ويرجع ذلك إلى عدد صغير من الخلايا العصبية في الدماغ، ومدى توافر الأدوات الوراثية لmanipul العصبيةأوجه. وقدم ضوء الظلام مقايسة تفضيل يسمح التحقيق في مجموعة من السلوكيات البصرية بما في ذلك السيطرة الإيقاعية من انجذاب ضوئي.
Introduction
هنا نحن تصف مقايسة السلوكية على أساس تفضيل اليرقات لمظلمة (أو الضوء). اليرقات تتفاعل مع استجابة قوية والنمطية سلبي ضوئي خلال مراحل تستخدم علفا (L1 إلى L3 في وقت مبكر) 1. ويهدف الفحص لتقييم السلوك رهاب الضوء من اليرقة ويقارن تفضيل الضوء أو الظلام لمجموعة من اليرقات تتحرك بحرية في طبق بتري المغلفة مع أجار. هذا الاختبار السلوكية يوفر معلومات حول حساسية، والتكامل والزمانية اللدونة من النظام البصري ليس فقط ذلك، فإنه يوفر المزيد من التلميحات حول كيفية التحكم في الحساسية للضوء وعملية من قبل نظام الساعة البيولوجية.
ذبابة الفاكهة اليرقات العين (أيضا يطلق Bowlig الجهاز؛ BO)، هو الجهاز الرئيسي للضوء التصور. وتتكون كل عين من 12 مبصرات (PR)، وثمانية المستفيدين الرئيسيين تعبر عن rhodopsin6 حساسة الخضراء (RH6) وأربعة المستفيدين الرئيسيين تعبر عن rhodopsin5 حساسة الأزرق (RH5) 2،3. بالإضافة إلى المستفيدين الرئيسيين، ALSوقد تم تحديد فئة O IV الخلايا العصبية multidendritic، التي تغطي جدار الجسم اليرقات، للاستجابة لشدة الضوء الضارة 4،5. ومن المعروف أيضا أن الخلايا العصبية جهاز تنظيم ضربات القلب تقع في وسط الدماغ اليرقات تعبر عن ضوء حساسية البروتين Cryptochrome (صرخة) الذي يقوم بدور جوهري على مدار الساعة استشعار الضوء الأزرق داخل الدماغ 6،7. يثير الاهتمام والفضول photophobicity من الحيوانات البرية نوع يظهر عنصر الإيقاعية في نقاط زمنية مختلفة في أثناء النهار والليل عند اختبار مع هذا الاختبار. وأظهرت الردود على ضوء تستخدم علفا L3 يرقة photophobicity أقوى عند الفجر وعند الغسق photophobicity أقل عند اختباره لتفضيل ضوء الظلام 7. ومن المثير للاهتمام ومطلوبة فقط RH5-PRS لتجنب ضوء، في حين RH6-PRS يمكن الاستغناء عنها. تشارك كل من، RH5-PRS وRH6-PRS في إعادة عقارب الساعة الجزيئية التي كتبها ضوء 8. يجب تنسيق مسار صرخة مع مسارات الاستشعار الخفيفة الأخرى إلى تنسيق الإخراج السلوكية المناسبة فيمدار اليوم. أستيل في المستفيدين الرئيسيين يلعب دورا أساسيا في سلوك التهرب ضوء وكذلك الرائعة على مدار الساعة الجزيئية. حجب العصبي أستيل من المستفيدين الرئيسيين لتنظيم ضربات القلب الإيقاعية الخلايا العصبية يقلل من استجابة رهاب الضوء في ضوء الظلام تفضيل مقايسة 8. توظيف نفس الفحص، وقد تم تحديد اثنين من أزواج متماثلة من الخلايا العصبية في الآونة الأخيرة لتبديل تفضيل ضوء الطور اليرقي الثالث من ذبابة الفاكهة 9. هذه الأزواج اثنين من الخلايا العصبية يمكن أن تعمل خلال مراحل اليرقات في وقت متأخر، عندما ترك الحيوانات الطعام إلى يفترض إيجاد موقع pupariation المناسبة. ومع ذلك، فإن مسألة كيفية تفاعل المسارات البصرية والتحكم في سلوك اليرقات البصرية بطريقة الإيقاعية لا يزال لم يتم الرد عليها إلى حد كبير. مقايسة تفضيل ضوء يسمح مقارنات بين نقاط الوقت الإيقاعية، ويطير الخطوط والدولة الإيقاعية تحت ضوء مختلف الصفات. الفحص هو تحضيرها بسهولة وغير مكلفة وكانت مفيدة سابقا أنان عدة مختبرات لوصف ودراسة سلوك الضوء المستمدة في اليرقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تربية اليرقات
- الحفاظ على السلالات يطير أو الصلبان الجينية في الثقافة الجماهيرية عند 25 درجة مئوية في المتوسط وجبة الذرة تحت ضوء-12-HR دورة 12 ساعة مظلمة في ذبابة حاضنة مجهزة ضوء وموقت.
- تمييع الداعم الخميرة في الماء لتكوين عجينة السوائل (10 غرام من الخميرة الداعم المخفف مع 3-4 مل المقطر H 2 O). إضافة قطرة صغيرة إلى الذرة وجبة الغذاء وتغطية قارورة. اسمحوا الجافة لمدة ساعة واحدة على الأقل لتجنب الذباب الكبار التمسك عجينة الخميرة. يمكن وضع قطرة صغيرة من الخميرة المخفف في الماء على سطح الطعام تعزيز وضع البيض. وبدلا من بيكر خميرة عجينة، وحامض الخليك 20٪ (AcOH) (سيغما الدريتش، سويسرا A6283-100ML) يمكن استخدامها. لهذا، وتراجع غيض من Q-تلميح على حل وانتشارها على السطح وجبة الذرة الغذاء.
- وضع الذباب الكبار (أربعة أيام على الأقل من العمر، ولكن لا يزيد عمرها عن عشرة أيام) في الذرة وجبة الغذاء قارورة. وضع ما يكفي من البالغين في كل قارورة من أجل الحصول على يرقات كافية لتكرار تفضيلاختبار عدة مرات، والسماح المقارنة الإحصائية. لالصلبان الجينية، ونحن عادة استخدام الحد الأدنى من 20 الإناث والذكور 5-10 في قارورة، ولكن بعض الخطوط تتطلب المزيد من الإناث للحصول على ذرية اليرقات كافية.
- تسمح البالغين لوضع البيض لمدة 12 ساعة ونقلها إلى قارورة جديدة. يمكن نقل البالغين في الصباح والمساء. ونحن عادة نقل البالغين لمدة سبعة إلى عشرة أيام، وإذا لزم الأمر تأخذ البالغين الجديدة.
- الحفاظ على مجموعات البيض تؤخذ كل 12 ساعة في الحاضنة والسماح تنمو اليرقات في 25 ° C، 12 ساعة ضوء 12 ساعة دورة الظلام والرطوبة 60٪. لاختبار مكونات الساعة البيولوجية للسلوك البصرية تمر اليرقات إلى ظلام مستمر (DD) 48 ساعة بعد جمع البيض (المقابلة لدورات مدتها ضوء الظلام). لهذا، استخدم حاضنة منفصلة من دون ضوء ولكن تبقى جميع الشروط الأخرى مثل درجة الحرارة والرطوبة متطابقة. تأكد من نقل قنينات إلى DD حاضنة فقط قبل التحول إلى مرحلة مظلمة. قبل أن ينتقل إلى قارورة عنوتوضع إيه حاضنة قارورة في صندوق من الورق المقوى أو التفاف قارورة مع رقائق الألومنيوم لمنع التعرض للضوء أثناء نقل (التعبئة والتغليف في صندوق من الورق المقوى أو التفاف الذي ينبغي القيام به خلال "أضواء على مرحلة" قبل التحول بين الحاضنات). منع الحيوانات من أي التعرض للضوء بعد هذه النقطة وحتى بداية التجارب.
- بعد 4 أيام (84-108 ساعة من وضع البيض) جمع في وقت مبكر L3 (اليرقات التغذية) في نقاط زمنية لفحصها (انظر 4. اختبار تفضيل الضوء، نقطة. 4.4).
2. إعداد اختبار
- إجراء تجارب في غرفة مظلمة مع درجة حرارة ثابتة وظروف الرطوبة.
- للحفاظ على اثنين من الأرباع طبق بيتري في الظلام، تغطية غطاء مع الشريط الأسود ورقائق الألومنيوم. من أجل القيام بذلك، بمناسبة وسط محيط الغطاء. أيضا علامة أربع نقاط في الحدود من الغطاء مع 90 درجة من الفصل بينهم. لجعله أسهل، رسم 20 سم مربع مقسمة في أربعة أجزاء 10 سم على طولورقة من الورق أو مع مساعدة من جهاز الكمبيوتر. قطع 10 سم الساحات من رقائق الألومنيوم والشريط الأسود (الشكل 1A). تغطية اثنين من الأرباع المعاكس من قبل الإلتصاق مربع من رقائق الألومنيوم، والطبقة الأولى وشريط أسود يغطي عليه، وتوخي الحذر ليشمل أيضا الحدود من الغطاء.
في الماضي كانت تستخدم شكلين مختلفين قليلا من هذه المقايسات. نحن هنا استخدام "ربع لوحة" الفحص، التي تنقسم طبق بيتري في أربعة أرباع متساوية 10. في البديل "نصف لوحة" مقايسة ينقسم طبق بيتري نصف (نصف تتعرض للضوء، ونصف في الظلام) 1،7،8. حتى اليوم تم نشر عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين المقايسات اثنين. - الغراء ورقة رباعي مثل تلك المستخدمة لوسم الأغطية الحق تحت مصدر الضوء على الطاولة. بمناسبة محيط من طبق بيتري تركزت على تقاطع الأرباع. استخدام علامات كمرجع لوضع لوحة اختبار دائما في نفس الموقف تحت مصدر الضوء.
- تثبيتمصباح، إما بسيطة لمبة الضوء الأبيض (فيليبس، Softtone 5W) أو مصباح LED (LED مصباح، 80012 الأبيض، أوسرام) فوق طبق بيتري مع مساعدة من موقف الدعم الحديد (فيشر العلمية، S47808). ضبط ارتفاع في هذه الطريقة أن لوحة الاختبار كله مضاءة متجانس. ونحن نوصي بشدة استخدام مصابيح LED لأنها تنبعث منها موجات أكثر تحديدا من المصابيح التقليدية. وعلاوة على ذلك المصابيح تنبعث منها حرارة أقل.
- ضبط شدة الضوء مع مساعدة من مقياس ضوئي (البيئة متر PCE EM882). لتحقيق كثافة الضوء المطلوب من 350-760 لوكس، نقل مصباح أعلى أو لأسفل على النحو المطلوب. توصيل مصباح إلى مصدر طاقة قابل للتعديل يعطي مزيدا من المرونة لتغيير شدة دون تحريك مصباح (1B الشكل).
3. لوحات إعداد
- جعل 200 مل من 2.5٪ أجار (سيغما الدريخ، سويسرا A5093-500G) مع الماء المقطر مزدوجة (ميليبور).
- وضع أطباق بتري على طاولة (90 ملم قطر؛غرينر بيو واحدة محدودة، 4550 Kremsmeinster، النمسا) في الصفوف للسماح صب الساخنة الاغاروز.
- غلي الاغاروز في الميكروويف حتى الحل هو شفاف تماما والسوائل. تأكد من أن المحلول السائل لا يحتوي على فقاعات. تنبيه: النقل بعناية الى طاولة المفاوضات لأن الحل يمكن أن تكون ساخنة جدا!
- صب الساخنة الاغاروز في أطباق بتري حتى يتم تغطية السطح كله متجانس مع طبقة رقيقة من الحل، عن اثنين أو ثلاثة ملليمترات ما يكفي. أن تكون سريعة لمنع الاغاروز ترسيخ قبل طلاء جميع لوحات. السماح لوحات يبرد. تخزين لوحات في درجة حرارة الغرفة واستخدامها فقط في نفس اليوم من التحضير.
4. ضوء اختبار ميول
- العمل في ظل ظروف الضوء الأحمر في غرفة التجربة لمنع تأثير ضوء قبل الاختبار منذ ذبابة الفاكهة ليست قادرة على الاحساس الأطوال الموجية من الضوء الأحمر. استخدام لمبة الضوء الأحمر (فيليبس، PFE712E * 8) شنت في مصباح لإضاءة رانه مكان للعمل.
- الحفاظ على درجة حرارة من خلال كل التجارب عند 25 درجة مئوية. مراقبة درجة حرارة الغرفة عن طريق جهاز سخان أو التبريد إذا لزم الأمر.
- تأخذ بعض الطعام من قوارير تربى لدورات لمدة يومين تحت ظلام مستمر (من الباب 1). منذ اليرقات عادة ما يتم حفر على سطح المواد الغذائية، واتخاذ الطبقة العليا (حوالي 5 ملم العميق) مع مساعدة من ملعقة (فيشر العلمية، 14-373-25A). انتشار الطعام على الجانب الخارجي لغطاء طبق بتري، وإضافة بعض الماء وتخلط بلطف مع ملعقة.
- جمع تغذية اليرقات L3 من الطعام. كما وسيتم اختبار تفضيل ضوء، واختيار فقط في وقت مبكر / التغذية L3 اليرقات أمر بالغ الأهمية نظرا لأنه أكد للانجذاب ضوئي سلبية. المرحوم / تجول L3 اليرقات أو يرقة كبيرة الزحف على الطعام يفترض تحولت بالفعل photobehavior بهم. ويمكن التعرف على تغذية اليرقات L3 (ضوئية سالبة) لأن الفتحات التنفسية الخاصة بهم الأمامية مفتوحة ويبرز إلى الخارج في شكل الإصبع تشبه. وشق الخلفيليالي لديها ثلاث فتحات لكل منهما، وأربع مجموعات من الشعر متفرعة كبير. الغدد اللعابية تمتد إلى الجزء الثاني البطن 11. انطلاق اليرقة تحت المجهر مريحة في حين عدم وجود ضوء أبيض ينبغي استخدامها. A مصباح الضوء الأحمر هو ضروري لإلقاء الضوء على يرقات إذا التدريج تحت المجهر مجسمة قبل مطلوب التجارب.
- غسل اليرقات لفترة وجيزة في ماء الصنبور، وجمع في وقت مبكر، تغذية اليرقات طور مرحلي الثالثة (لا يزال في الضوء الأحمر). قبل نقل اليرقات إلى لوحة الاختبار، واتخاذ اليرقات مع الرسام الرطب وامتصاص المياه الزائدة بعناية مع منشفة ورقية أو ورق الترشيح. لا تجف اليرقات بشكل مفرط للغاية لأنه يمكن أن يؤذي الحيوان والتأثير على سلوكها.
- باستخدام فرشاة الرسام الرطب بعناية نقل اليرقات إلى لوحات. وضع مجموعة من حوالي 30 اليرقات في وسط اللوحة. تغطية لوحة مع غطاء أعدت بالفعل مع الأرباع وتعيين لوحة تحت مصدر ضوء استعداد لتجربة (انظر ثانيةنشوئها 2).
- تشغيل مصباح الضوء الأبيض وبدء موقت. السماح لليرقة التحرك بحرية على لوحة لمدة 5 دقائق، ثم بسرعة إزالة الغطاء وحساب عدد اليرقات في الظلام والضوء في الأرباع. يمكن وسم موقف كل يرقة مع علامة تخفيف العد. وبدلا من التقاط صورة للوحة والاعتماد لاحقة. اليرقات تظهر تفضيل ضوء غير واضحة، مثل اليرقات الزحف على الجدران أو تختبئ في أجار ينبغي اعتبار تفضيل محايد ومجرد إدراجها في عدد من اليرقات عندما يتم حساب مؤشر تفضيل ضوء.
- بعد العد، وتجاهل لوحة مع اليرقات واستبدالها مع لوحة اختبار جديد للتجربة القادمة. جمع لوحات المستخدمة في كيس من البلاستيك الأوتوكلاف في وقت لاحق المناولة والتخلص منها.
- وبمجرد الانتهاء من إجراء عدد كاف من التجارب يمكن اختبار تركيب وراثى جديد. 10-15 المحاكمات في التركيب الوراثي كافية للتحليل.
5. s تحليل البياناتق
- لراحة نقل البيانات إلى ورقة بيانات وإكسل (مايكروسوفت) أو المنشأ (معمل المنشأ) على جهاز كمبيوتر لمزيد من التحليل الإحصائي. ترتيب في عمود واحد على عدد من الحيوانات في الظلام، في العمود الثاني عدد الحيوانات في الأرباع ضوء وفي الثالث الكلي للحيوانات في لوحة (بما في ذلك اليرقات "محايدة").
- حساب مؤشر تفضيل (PREF) للظلام لكل تجربة باستخدام الصيغة التالية:
PREF (الظلام) = (عدد اليرقات في الظلام - عدد اليرقات في ضوء) / العدد الإجمالي لليرقات - قارن إحصائيا مجموعة من البيانات مع تحليل المناسبة للمجموعات. هنا، ونحن نستخدم اختبار يلكوكسون لمقارنة إحصائية مجموعتين. اختبار ANOVA مع متعددة مقارنة لتوكي اللاحق يمكن أن يتم الاختبار، وإذا تم الوفاء افتراض التوزيع الطبيعي في مقارنة مجموعة متعددة.
- جعل الرسوم البيانية التي تظهر بوضوح مقارنات بين الخطوط والنقاط الزمنية على طول دورة يوم. Wه استخدام البرامج الأصلية (مختبر المنشأ) لاختبار دلالة إحصائية وتوليد الرسوم البيانية المناسبة، ولكن أي برنامج إحصائية أخرى يمكن أن تكون مفيدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد بروتوكول الموصوفة أعلاه، ونحن اختبار تفضيل ضوء الظلام في وقت مبكر ملعب اليرقات الثالثة من النوع البري كانتون-S تطير في اثنين من مختلف الأوقات الإيقاعية CT0 وCT12. وقد تربى البالغين 12 ساعة ضوء-12-HR الظلام وغادر لوضع البيض لمدة 12 ساعة. اليرقات تنمو في أول يومين في إطار نفس النظام ضوء الظلام. منذ كنا نريد لاختبار التشكيل الإيقاعية في ظل ظروف ثابتة (تشغيل الخطوط على مدار الساعة الإيقاعية)، ثم تم نقل اليرقات إلى ظلام مستمر للأيام الثلاثة المقبلة حتى تم إجراء اختبار (الشكل 3A).
هنا، استخدمنا 350 لوكس منذ فقد تبين أن هذا هو شدة الضوء الأمثل للكشف عن الاختلافات في استجابة ضوء يرقة ذبابة الفاكهة على طول دورة الساعة البيولوجية مقارنة كثافات أخرى (70 و 600 لوكس) 7. ويلاحظ اختلافات في الحساسية للضوء، وبالتالي في ضوء استجابة عند مقارنة CT0 مع CT12. في ذبابة الفاكهة، CT0 تتزامنو مع الفجر، ويعتبر نصف دورة بين CT0-CT12 اليوم شخصي ومن CT12 إلى CT24 الليل شخصي 12. حساسية الضوء هو أعلى لفترة وجيزة بعد الانتقال من الظلمات إلى النور، عندما تقريبا 77٪ من اليرقات تفضل الظلام مقارنة مع ما يقرب من 69٪ من أفضلية الظلام في الليل شخصي في وقت مبكر (الشكل 3B). وينعكس هذا أيضا تلاه مؤشر تفضيل الظلام (PREF (الظلام)) المحسوبة مع الصيغة الواردة أعلاه لكل تجربة. في المتوسط كل التكرار حصلنا على مؤشر تفضيل 0.52 لCT0 و0.36 لCT12. باستخدام اختبار يلكوكسون (المنشأ) فرق ذات دلالة إحصائية بين نقطتين مرة يتم فيها عرض (P = 0.0229).
الشكل 1 (أ) وضع علامات الأرباع في الأغطية طبق بيتري. يمكن أن تكون علامة الأرباع في غطاء طبق بتري مع تعليمات من رباعي المطبوعة تستخدم قماش. خلفي ويمكن لصقها في الطبقة الأولى من رقائق الألومنيوم على السطح الخارجي للوحة وتغطيتها مع شريط أسود في اثنين من الأرباع المعاكس للظلام. (B) تحدد تخطيطي لحضور اختبار تفضيل ضوء الظلام. (C) A بيتري طبق مغطاة الأرباع مظلمة ومليئة 2.5٪ أجار، وعلى استعداد لاستخدامها في التجارب. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. اختبار تفضيل ضوء الظلام، مثال على الطبق مباشرة بعد وضع اليرقة على لوحة الاختبار (ابدأ) وبعد 5 دقائق (النهاية). عادة، ونحن نستخدم مجموعة من 30 الحيوانات لكل تجربة.
tp_upload/50237/50237fig3.jpg "بديل =" الشكل 3 "FO: محتوى العرض =" 5.5in "FO-SRC =" / files/ftp_upload/50237/50237fig3highres.jpg "/>
الشكل (3). (A)، يليه نظام الضوء لاختبار تفضيل ضوء في تغذية يرقة L3. (B) النسبة المئوية للتفضيل الظلام لكلا الوقت يشير اختبار (CT0 وCT12). النسبة المئوية لليرقة أن الظلام المفضل وضوء تحسب لكل التكرار والتكرار فقط عن متوسط. وتعتبر اليرقات في الحدود من لوحة أو حفر على أجار للإجابات المتعادلة. (C) مؤشر تفضيل الظلام يحسب للنقاط نفس الوقت. ويظهر فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات حسب يلكوكسون اختبار مجموع رتبة (P <0.05). (N = 18 (540 اليرقات) في نقطة زمنية). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
اختبار تفضيل ضوء صفها يستفيد من photobehavior الفطرية اليرقات. مقايسة من السهل أن تنشئ، يسمح بالكثير من التكرار بتكلفة منخفضة وتوفر معلومات قيمة حول الاستشعار عن الضوء والمعالجة. النموذج التجريبي يسمح الكمي السريع نسبيا عن كيفية العديد من الأفراد يفضلون الضوء أو الظلام. يمكن عرض هذه الأفضلية كنسب مئوية الخام أو بدلا من ذلك كما مؤشر ميول (PREF). يتم التعبير عن PREF على أساس الفرق من الحيوانات التي الخفيفة والحيوانات المفضل أن الظلام المفضل مقسوما على مجموع من الحيوانات.
وهناك نقطة حاسمة بالنسبة لاختبار تفضيل الضوء هو فترة التجارب. هنا، نحن اختبار خمس دقائق، ومع ذلك فمن الممكن أن الأنماط الجينية الأخرى أو تحت غيرها من الصفات ضوء الاختلافات ليست واضحة وذلك باستخدام هذه المدة التجربة. لمثيرات معينة (الذوقية) أدركنا أن التجارب لفترة أطول، مع 20 دقيقة من مدة، وتقديم preferen النظيفCES مع تقلبية أصغر. يمكن اختبار فترات تجريبية مختلفة تكون عادلة وخاصة عند استخدام التراكيب الوراثية حيث يتأثر تحرك أو حساسية واليرقات تتطلب وقتا أطول لاستكشاف لوحة الاختبار. في هذه الحالة، فإن الوقت ينبغي تعديل بالتساوي للضوابط والأنماط الجينية التجريبية.
الفحص أيضا يتيح الكشف عن الاختلافات بين نقاط وقت من اليوم من خلال دورة الساعة البيولوجية كما هو موضح هنا و7،13 في تقارير سابقة. ويتم تنظيم الاستجابات للمؤثرات ضوء ضوئي قوي من الساعة اليومية، ويفترض من قبل تحوير حساسية المستقبلات الضوئية. ردود اليرقات إلى النور انخفاضا خلال أول ساعتين من اليوم وأصبحت مستقرة خلال عشر ساعات المتبقية من المرحلة ضوء. لمقارنة مجموعات مختلفة في أثناء النهار، فمن الأهمية بمكان أن يقوموا بتجارب على ما يعادل أو متطابقة نقاط زمنية من دورة الساعة البيولوجية لكل مجموعة. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المهم أيضا تجنب التغييرات التييمكن أن تؤثر على سلوك اليرقات، عن التقلبات الحرارية أو المدخلات ضوء التجارب السابقة إلى إذا كان يعمل في الظلام. لهذا، من المهم لتربية اليرقات في نفس درجة الحرارة والرطوبة من تلك التي استخدمت لإجراء التجارب وتوخي الحذر عن طريق الحفاظ على الحيوانات في الظلام عند الحاجة.
على الأقل ثلاثة مسارات وصف مؤخرا تساهم في ضوء الاستشعار في يرقة ذبابة الفاكهة 5،14: 1) النظام يعتمد رودوبسين بوساطة العين اليرقات؛ 2) الخلايا العصبية multidendritic الدرجة الرابعة، وانتشار على طول الجسم اليرقات و 3) على مدار الساعة الجوهرية أجهزة استشعار الضوء الأزرق معربا عن البكاء. مساهمة مسارات الاستشعار ضوء متميزة للسلوك البصرية يمكن معالجتها من خلال اختبار تفضيل هو موضح هنا. مصادر مختلفة من الإضاءة مع شدة وموجات محددة يمكن استخدامها لاختبار الصفات ضوء مختلف. هذا الاحتمال يمكن أن تعتمد على تفاصيل حول حساسية من العناصر الفردية للنظام الاستشعار ضوء علىد كيف تتم معالجة هذه المدخلات ضوء. لتجريب أكثر تفصيلا بشأن التحفيز على ضوء ذلك، مقايسة يمكن تعديلها بسهولة لاختبار الصفات ضوء مختلف. زيادة وخفض شدة الضوء، وكذلك اختبار موجات الضوء المختلفة هو ممكن باستخدام عصامي مصابيح LED مع موجات محددة (العديد من الإمكانيات المتاحة في السوق). السيطرة على هذه المصابيح مع إمدادات الكهرباء تقدم مجموعة جيدة من شدة. هذه الاحتمالات لمعالجة الصفات ضوء توفير مجموعة واسعة من المتغيرات التي سيتم اختبارها مع اختبار تفضيل ضوء.
وعلاوة على ذلك، يرقات ذبابة الفاكهة قادرون على المنتسبين العقاب أو المكافآت مع أي ضوء أو ظلام، وتعديل photobehavior الأصلية 15. لهذا، كان يعمل على التكيف التابع لبروتوكول صفها تظهر براعة للمقايسة. وباختصار، فإن اختبار تفضيل ضوء الظلام هو أداة قيمة المساهمة مع فهم أفضل من السريعوالسلوكيات الإيقاعية المستمدة من المنبهات الخفيفة والتي عناصر النظام حساسة للضوء وعلى مدار الساعة الإيقاعية لليرقة ذبابة الفاكهة وتشارك في هذه العملية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر زملائنا في قسم الأحياء، جامعة فريبورغ لإجراء مناقشات مثمرة. نشكر مركز ألبوم بلومينغتون لتوفير مخزونات الطيران. وأيد هذا العمل ماليا من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (PP00P3_123339) ومؤسسة VELUX إلى SGS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A5093-500G | 2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland |
| Petri dishes | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | 90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria |
| LEDs Lamp | OSARAM | 80012 White | LED lamp, 80012 White |
| Environment Meter | PCE | PCE EM882 | Lux, Temp, RH% |
| Thermostatic cabinet | Aqua Lytic (Liebherr) | ET636-6 | |
| Light timer | Timer T | 6185.104 | 230V/50HZ (check specifications for your country) |
| Universal thermostat | Conrad | UT200 | |
| Humidifier | Boneco | ||
| Balck tape | Tesa | 5 cm | |
| Glue | Uhu | ||
| lncubator lamp | Phillips | Softtone | 5W |
| Timer clock | Ziliss | Ziliss, Switzerland | |
| Excel Software | Microsoft | Excel | |
| Origin Software 8.5 | OriginLab | ||
| Backer Yeast | Migros Switzerland | ||
| Iron support stand 17X28CM | Fisher Scientific | S47808 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283-100ML | 20% acetic acid dilluted in H2O |
| Red light lamp | Phillips | PFE712E*8C | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Power supply | EA | EA PS 2042-06B | Optional |
| Aluminium foil | Prix Coop | ||
| Heater | GOON | NSB200C | |
| Microwave Oven | Intertronic | ||
| Standard corn meal fly food | |||
| Destilled water |
References
- Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development. J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).
- Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates. Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454, 533-537 (2008).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Diaz, N. N., Sprecher, S. G.
- Emery, P., et al. Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor. Neuron. 26, 493-504 (2000).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45, 293-300 (2005).
- Keene, A. C., et al. Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment. J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).
- Gong, Z. F., et al. Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference. Science. 330, 499-502 (2010).
- Lilly, M., Carlson, J. smellblind: a gene required for Drosophila olfaction. Genetics. 124, 293-302 (1990).
- Bodenstein, D. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. Demerec, M. , John Wiley & Sons. 275-367 (1950).
- Pittendrigh, C. S. Circadian systems: Entrainment. Biological Rhythms. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, Plenum. 95-124 (1981).
- Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila. Neuron. 74, 706-718 (2012).
- Keene, A. C., Sprecher, S. G. Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae. Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).
- von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).
