Telomere Lengde og telomerase aktivitet; En Yin og Yang av Cell Senescence

Summary

En nøyaktig, kort, sofistikert og billig metode er beskrevet som vurderer telomere lengde i flere vev og arter ved hjelp QRT-PCR. I tillegg vil vi beskrive en enkel analyse for å vurdere telomeraseaktivitet som en komplementær ryggrad test for telomer-lengde.

Abstract

Telomerer gjentar DNA-sekvenser på spissen ender av kromosomene som er forskjellige i lengde, og i mennesker kan nå en lengde på 15 000 basepar. Den telomere tjener som en mekanisme Biobeskyttende av kromosom slitasje ved hver celledeling. I en viss lengde, telomerer blir for kort til å tillate replikasjon, en prosess som kan føre til ustabilitet kromosom eller celledød. Telomerlengde er regulert av to motstridende mekanismer: avgang og tøyelighet. Slitasje oppstår som hver celle deler seg. I motsetning, er forlengelsen delvis modulert av enzymet telomerase, som legger gjentatte sekvenser til endene av kromosomene. På denne måten kan telomerase muligens reversere en aldrende mekanisme og forynger celle levedyktighet. Dette er viktige elementer i å opprettholde celle liv og brukes til å vurdere cellulær aldring. I dette manuskriptet vil vi beskrive en nøyaktig, kort, sofistikert og billig metode for å vurdere telomere lengde i flere vevs og arter. Denne metoden tar fordel av to hovedelementer, tandem gjentagelse av den telomer-sekvens og følsomheten av QRT-PCR for å påvise differensielle kopi antall testede prøver. I tillegg vil vi beskrive en enkel analyse for å vurdere telomeraseaktivitet som en komplementær ryggrad test for telomer-lengde.

Introduction

Telomerer er å gjenta DNA hexamer (TTAGGG) sekvenser funnet på endene av kromosomene. I hver celle replikasjon, er disse kromosom ender forkortet. Hvis de blir for kort, kan kromosomer gjennomgå telomere end fusjoner, avvikende rekombinasjon, og nedbrytning. Dermed tilstrekkelig telomerlengde vedlikehold spiller en stor rolle i kromosom stabilitet og cellebeskyttelse ^38. Telomerlengde vedlikehold er også avgjørende for gener funnet nær endene av kromosomene, siden DNA replikering ikke kan fortsette helt til enden av kromosomene ^1-2. Følgelig kan forebygging av telomerer forkortes forbedre celle stabilitet.

Tallrike studier har rapportert at telomer-lengden er korrelert med en organisme lange levetid og tilstand av sykdom, slik som kreft i ^3-4, diabetes ^5, og kardiovaskulær sykdom ^6,7. I tillegg har forkortet telomerer blitt assosiert med overdreven belastning eller enusunn livsstil ^åtte, kanskje ved å fremme tidlig celle aldring og død ^9. På den annen side har enkelte studier funnet at det er ingen signifikant forskjell mellom telomerlengde og lang levetid og aldersrelatert ^{39 sykdom, 40, 41.}

En av cellens iboende mekanismer av beskyttelse fra telomerer forkortes er ved å aktivere dens eget enzym telomerase revers transkriptase (tert). Dette enzymet og dens subenhet, telomerase RNA (TERC), en ikke-kodende RNA, bruker telomere som en mal for å legge telomere gjentar til kromosom ender ^10. Selv telomeraseaktivitet er fraværende fra flere typer av celler og andre mekanismer som er involvert i telomerlengde vedlikehold, er økt telomeraseaktivitet korrelert med økt telomer-lengde. Telomerase aktivering er etablert som en av mekanismene ved hvilke celler reagerer på skade og stress og unngå for tidlig senescens og død. For eksempel lenger telomeres ble demonstrert i en populasjon av askenasiske jøder med eksepsjonell levetid ^11, har mutasjoner i TERC eller tert vist seg å bidra til dødelig sykdom ^12, og epigenetisk regulering av telomerase har vist seg å ha en effekt på aldersrelatert sykdom ^13. Siden oppdaget, har telomerlengde blitt foreslått som en biomarkør for helsetilstanden i forskjellige dyremodeller, samt hos mennesker, men disse tidlige studiene var vanskelige å allment replikere fordi den metode som ble brukt var langtekkelig, lang og kostbar. I 2002 og videre innstilt i 2009 foreslo Cawthon og demonstrert en ny, nøyaktig, rask og enkel PCR-basert protokoll for å vurdere telomerlengde og videre undersøke dens rolle i ulike aspekter av cellebiologi, aldring og sykdom ^19.

Velge riktig telomere målemetode for en studie er viktig. For tiden er det ulike metoder som brukes for å måle telomerlengde, hver med sin egenfordeler og ulemper. Tradisjonelt er telomerlengde målt ved hjelp av Southern blot-analyse av restriksjons-terminale fragmenter (TRFs), som omfatter: et. fordøye DNA med restriksjonsenzymer som ikke kutte i telomere gjentar for å få TRFs, f.. Southern blot av disse TRFs gjøres ved bestemmelse av den midlere TRF lengde ved hjelp av en sonde telomeric ^{14, 37..} Selv om denne metoden er meget nøyaktig med en liten variasjonskoeffisient, er et direkte mål, og kan være en fordel for lengdemåling fordeling, er TRF analyse kostbar, arbeidskrevende og krever minst 3 ug DNA. Denne metoden er også følsom for korte telomerer og lengde besluttsomhet kan bli gjort til skamme ved subtelomeric DNA, som kan oppdages ved sonden på grunn av (TTAGGG) n som sekvenser de inneholder ^{15, 42.}

En annen svært nøyaktig metode å måle telomerlengde er Single Telomere Forlengelse Lengde Analysis (STELA), en single molekyl PCR-basert metode som bare krever en liten mengde DNA. I denne metoden, blir primere laget for å gjenkjenne den G-rike overheng ved enden av kromosomer og til å binde til et unikt subtelomeric sekvens på ett kromosom, som forsterker den telomere av en spesifikk kromosom. Den resulterende forsterkning er så visualisert ved Southern Blot. Denne metoden har fordelen av å være svært nøyaktig og er i stand til å gjenkjenne korte avvikende telomerer ^16. Dessverre, siden ikke alle kromosomene har G-rike ender og en brukbar subtelomeric sekvens, kan telomerlengde bare måles på bestemte kromosomer og disse målingene kan ikke representere lengden på alle telomerer i cellen ^15.

En annen metode som har vært praktisert er bruken av Peptide Nucleic Acid (PNA) prober for å detektere telomerlengde. Kvantitativ Florescence in situ hybridisering (Q-FISH) tillater oss å visualisere telomerer under metafasen, der staining av telomerer med en PNA sonde i forhold til deres størrelse tillater sammenligning av telomerer mellom spesifikke kromosomer. Selv om denne metoden kan også benyttes for celler i interfase, her den telomer-lengde for forskjellige kromosomer ikke kan avleses, noe som innfører en begrensning ved måling av telomer-lengde i senescent eller sjelden delende celler ^17. Flow FISH bruker i stedet flowcytometri og er i dag den mest sensitive metoden for måling telomerlengde av blodceller i klinisk setting, men krever høyt kvalifiserte teknikere ^18.

Foreløpig tar standard metode for å måle gjennomsnittlig telomere lengde i vårt laboratorium nytte av presisjon, følsomhet, og enkel kvantitativ real-time PCR. Denne metoden ble gjort mulig for måling telomerlengde ved utvikling av nye primere som unngår syntese av primer dimer avledede produkter, som ellers ville ha blitt produsert i såtandard analysen på grunn av den gjentatte natur av telomerer. For denne analyse er måling av telomer-lengde representert ved T / S-forhold, telomere gjentatt kopiering nummer til enkelt-kopi-genet nummer. Siden det er et direkte proporsjonalt forhold mellom det telomerlengde og antallet av merkede primere telomere binding til DNA under de innledende stadier av PCR, er T / S-forhold direkte proporsjonal med telomerlengde. T / S ratio måles ved å sammenligne forskjellen i Ct, krysser brøk syklus nummer der prøven er akkumulert florescence en terskel som er flere standardavvik over baseline florescence, mellom prøver med telomere primere og SCG primere ^19. Denne metoden har blitt kritisert for indirekte måling av telomer-lengde, noe som kan føre til unøyaktige målinger, for eksempel, i tilfellet av kromosom duplikasjoner eller kopitall variasjoner ^15. Dessuten er sammenligning mellom studier ofte difficult, men standard oligomers har blitt utviklet for å måle absolutte telomerlengde ^20. Denne metoden ble fremmet forbedres ved Cawthon, ved hjelp av en monokrom multiplex qPCR analysen. I denne analyse ble den PCR drives ved lavere temperaturer for de første sykluser for å unngå primer-dimer binding og den telomere og kontroll-genet ble analysert i den samme PCR-røret for å unngå ytterligere feil. Den resulterende telomere lengdemålingene sterkt korrelert med telomere lengde målt ved Southern blot analyse av TRFs og hadde høyere nøyaktighet ^{15, 19, 36.} For øyeblikket er QRT-PCR den eneste praktiske metoden tilgjengelig for testing store utvalgsstørrelser og krever bare en liten mengde DNA til å gjennomføre. En viktig del av denne metoden er omfattende kvalitetskontroll tiltak, slik at når det er gjort riktig, kan denne metoden gi verdifull komparativ informasjon om telomerlengde. I tillegg hadde denne metode blitt tilpasset for bruk som går ut leukocytter for å måletelomere lengde i en rekke forskjellige vev ^42..

I tillegg, for videre å forstå biologi bak telomerlengde vedlikehold og interaksjoner mellom de to motsatte effekter (dvs. telomerer forkortes under replikasjonen og forlengelse av telomerase-enzym), ledsaget vi den telomerlengde-metoden med en ytterligere metode som måler telomeraseaktivitet.

For dette formålet, brukte vi en Telomeric Gjenta Amplification Protocol, en in vitro-analysen. Kort, lysert, bevares, enzymatisk aktive celler syntetisert telomeric gjentar på en oligonucleotide underlaget med telomerase, og produktene ble forsterket ved hjelp av PCR i nærvær av SYBR Grønn. Resultatene ble deretter analysert ved å sammenligne prøve og kontroll-Ct-terskelverdier. Siden telomerase er en varme-sensitive enzym, er en ekstra varmebehandlet kontroll kjøre sammen hver prøve ^21.

<p class="Jove_content"> Når du måler telomerlengde kan gi verdifull innsikt i mulige rolle telomere lengde i patofysiologien av aldring og sykdom, er telomerlengde ikke et statisk eiendom og mer informasjon er nødvendig for å forstå telomere funksjon. Telomerase aktivitet studier kan legge til informasjon om telomerlengde reguleringsmekanismer. For eksempel kan den kontrollerte aktivering av telomerase opprettholde telomerlengde og celleproliferasjon, men ukontrollert aktivering av telomerase kan resultere i cancer. Disse to rimelige og rett frem metoder kombinert gitt oss ikke bare med sterkere bevis mot et forhold mellom telomere lengde og celle stabilitet, men også ytterligere innsikt i de mulige mekanismene for telomerer forkortes og utvinning. Med disse metodene håper vi å ytterligere belyse cellens respons på aldring og ulike tilstander av celleproliferasjon med det endelige målet om en bedre forståelse av sentrale mechanisms i cellebiologi.

Protocol

En. Telomerlengde Protokoll 19 DNA isolering De fleste DNA isolering metoder kan benyttes. Vår Lab foretrekker Qiagen DNeasy Kit (# 69506) for blod kilder. Avhengig av kilden til DNA, for eksempel buccal eller andre kilder, kan en annen metode for isolering brukes. Grunning: Alle primere er fortynnet til en konsentrasjon på lager 100pmoles/μl i PCR kvalitetsbestemt vann og lagret ved -20 ° C inntil beho…

Representative Results

Et eksempel på et telomerlengde QRT-PCR-analyse er vist i figur 1.. På venstre panel, prøver merket i rødt og grønt representerer plasseringen av de testede fagene på 96-brønners plate. På den øvre høyre panelet er amplifikasjonskurve demonstrert. Hvert motiv er testet av to analysene (Telomere og Single Copy Gene), som er gjort i triplicates. På grunn av forskjellige DNA-kopi tall som produseres i de to analyser av utvalgte individer, når antallet av sykluser inntil florescence deteksjon de…

Discussion

Telomerlengde gir en unik mobilnettet markør for å studere stresset og aldrende celle og gir innsikt i mekanismene for aldring. Siden sin rolle i aldring først hadde blitt foreslått, har en rekke studier er gjort om telomerlengde til alder, lang levetid, aldersrelaterte sykdommer, kreft, og stress. I flere tiår var gullstandarden av telomere lengdemålingene terminal begrensning fragment analyse ved hjelp av Southern hybridisering. Men nylig en rimelig, rask og enkel å utføre metoden ved Cawthon har utviklet seg….

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Quantitative Telomerase Detection	Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy Kit	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument	Roche Diagnostics	4707516