Длиной теломер и теломеразы, Инь и Ян клеточного старения

Summary

Точные, короткие, сложные и дешевый способ описан, который оценивает длину теломер во многих тканях и видам использования Qrt-PCR. Кроме того, мы опишем простой анализ для оценки активности теломеразы в качестве дополнительного теста для основы длину теломер.

Abstract

Теломеры повторяющихся последовательностей ДНК на конце концов хромосом, которые разнообразны по длине и в организме человека может достигать в длину 15 000 пар оснований. Теломер служит биозащитные механизм хромосомы истощение в каждом делении клетки. В определенной длины, теломеры становятся слишком короткими, чтобы репликация, процесс, который может привести к хромосомной нестабильности или гибель клеток. Длина теломер регулируется двумя противоположными механизмами: истощение и удлинения. Истощение происходит в каждом делении клетки. В противоположность этому, удлинение частично модулированный с помощью фермента теломеразы, который добавляет повторяющихся последовательностей на концах хромосом. Таким образом, теломераза, возможно обратное механизма старения и омолаживает жизнеспособности клеток. Они играют ключевую роль в поддержании жизни клетки и используются для оценки клеточного старения. В этой рукописи мы опишем точные, короткие, сложные и дешевый метод оценки длины теломеров в различных тканяхс и видов. Этот метод использует два основных элемента, тандемных повторов теломер последовательности и чувствительность QRT-PCR для обнаружения дифференциального числа копий испытуемых образцов. Кроме того, мы опишем простой анализ для оценки активности теломеразы в качестве дополнительного теста для основы длину теломер.

Introduction

Теломеры повторяющиеся ДНК гексамер (TTAGGG) последовательности, найденные на концах хромосом. В каждой клетке репликации, эти концы хромосом укорачиваются. Если они становятся слишком короткими, хромосомы могут подвергаться теломер слияний конца, аберрантными рекомбинации и деградации. Таким образом достаточную длину теломер обслуживания играет важную роль в обеспечении стабильности хромосом и клеточной защиты ^38. Длина теломер также имеет решающее значение для генов, найденных вблизи концов хромосом, так как репликация ДНК не может продолжаться до самого конца хромосом ^1-2. Следовательно, предотвращение укорочения теломер клетка может улучшить стабильность.

Многочисленные исследования показали, что длина теломер коррелирует с долговечность организма и болезненное состояние, например, в ^3-4 рак, диабет ^5, а также сердечно-сосудистые заболевания ^6,7. Кроме того, укороченные теломеры были связаны с чрезмерным напряжением илинездоровый образ жизни ^8, возможно, путем поощрения преждевременного старения и гибели клеток ^9. С другой стороны, некоторые исследования показали, что нет никакой существенной разницы между длиной теломер и долголетием и возрастных заболеваний связаны ^{39, 40, 41.}

Один из врожденные механизмы клетки защиты от укорочение теломер является путем активации фермента своя теломеразы обратной транскриптазы (трет). Этот фермент и его субъединицы теломеразы РНК (TERC), некодирующих РНК, используйте теломер в качестве шаблона для добавления теломер повторений, чтобы концы хромосом ^10. Хотя активность теломеразы отсутствует из нескольких типов клеток и других механизмов, которые участвуют в поддержании теломер длину, увеличение теломеразной активности коррелирует с увеличением длины теломеры. Активация теломеразы было установлено как один из механизмов, посредством которых клетки реагируют на повреждения и стресс и предотвратить преждевременное старение и смерть. Например, те большеlomeres были продемонстрированы в популяции евреев-ашкенази с исключительной продолжительностью жизни ^11, мутации в TERC или трет было показано, что вклад в смертельной болезни ¹² и эпигенетической регуляции теломеразы как было показано, влияют на возрастных заболеваний ^13. С момента своего открытия, длина теломер была предложена в качестве биомаркеров для состояния здоровья в различных животных моделях, а также у людей, но эти ранние исследования были широко трудно повторить, потому что был использован способ утомительно, долго и дорого. В 2002 году и в дальнейшем настроены в 2009 году, Cawthon предложены и продемонстрировали новый, точный, быстрый и простой протокол на основе ПЦР для оценки длины теломеров и дальнейшего изучения его роли в различных аспектах клеточной биологии, старение и болезни ^19.

Выбор правильного метод измерения теломер для исследования имеет важное значение. В настоящее время существуют различные методы, используемые для измерения длины теломеров, каждый со своим собственнымпреимущества и недостатки. Традиционно, длина теломер измеряется с помощью блот-анализе фрагментов терминал ограничения (ПВР), которая включает в себя:. переваривание ДНК ферментами рестрикции, что не режут теломер повторяется для получения TRFs, б. Саузерн-блот этих TRFs делается путем определения средней длины TRF помощью теломер зонд ^{14, 37.} Хотя этот метод очень точно с малым коэффициентом вариации, является непосредственной мерой, и может быть выгодным для измерения длины распределения, TRF анализ является дорогостоящим, трудоемким и требует, по крайней мере, 3 мкг ДНК. Этот метод также нечувствительно к короткие теломеры и определения длины можно смешивать по субтеломерных ДНК, которые могут быть обнаружены с помощью зонда связи (TTAGGG) н подобные последовательности они содержат ^{15, 42.}

Другой очень точный метод измерения длины теломер Одноместный теломер длина анализа удлинение (STELA), синглэлектронной молекулы на основе ПЦР методом, который требует лишь небольшого количества ДНК. В этом методе праймеры, чтобы признать G-богатые выступ в конце хромосом и связывается с уникальным субтеломерных последовательности на одной хромосомы, который усиливает теломер конкретной хромосоме. В результате усиления затем визуализируется Саузерн-блоттинга. Этот метод имеет то преимущество, что высокой точностью и способен обнаруживать короткие теломеры выброса ^16. К сожалению, поскольку не все хромосомы имеют G-богатые концах и полезной субтеломерных последовательность, длина теломер можно измерить только на конкретных хромосом и эти измерения не могут представлять длина всех теломеры в клетке ^15.

Другой метод, который практикуется является использование пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК) зондов для обнаружения длины теломеры. Количественные Florescence в гибридизация (Q-FISH) позволяет визуализировать теломер во время метафазы, где йAining теломер с зондом PNA пропорционально их размер позволяет сравнение между конкретными теломеры хромосом. Хотя этот метод также может быть использован для клеток в интерфазе, вот длину теломер хромосом для разных не могут быть обнаружены, которая вводит ограничения при измерении длины теломеров в стареющих или редко делящиеся клетки ^17. Поток рыбу вместо проточной цитометрии используется и в настоящее время является наиболее чувствительным методом для измерения длины теломеры клеток крови в клинических условиях, но требует высокой квалификации техников ^18.

В настоящее время стандартного метода измерения средней длины теломер в нашей лаборатории использует точность, чувствительность и простота количественной ПЦР в реальном времени. Этот способ стал возможным для измерения длины теломер по разработке новых праймеров, которые избежать синтез димера праймера полученных продуктов, которые иначе были произведены в качествеtandard анализа из-за повторяющегося характера теломер. Для этого теста измерения длины теломер представлена ​​T / S коэффициент, теломер числа копий повтора к одной копии гена числом. Так как существует прямая пропорциональная зависимость между длиной теломер и количество меченых праймеров теломер связывания с ДНК во время начальной стадии ПЦР, T / S соотношение прямо пропорционально длине теломеров. T / S коэффициент измеряется путем сравнения разности Ct, дробное число циклов, при которой образец накопленных цветение пересекает порог, который несколько стандартных отклонений выше базового цветения, между образцами с теломер праймеры и праймеры SCG ^19. Этот метод был подвергнут критике за ее косвенного измерения длины теломер, которые могут привести к неточным измерениям, например, в случае хромосомных дублирования или вариации числа копий ^15. Кроме того, сравнение исследований часто диfficult, но стандартные олигомеров и созданы для измерения абсолютного длину теломер ^20. Этот метод способствовал повышена за счет Cawthon, используя монохромный анализа кПЦР мультиплекса. В этом анализе ПЦР проводили при более низких температурах в течение первых нескольких циклов, чтобы избежать праймер-димеров связывания и теломер и контрольного гена были проанализированы в той же пробирке ПЦР дальнейшей избежать ошибки. Полученный в результате измерения длины теломер коррелирует с длиной теломер измеряется Саузерн-блоттинга из ПВР и имели более высокую точность ^{15, 19, 36.} На данный момент Qrt-PCR является единственным удобным способом для тестирования больших размеров образца и требует лишь небольшого количества ДНК осуществить. Важной частью этого метода заключается в комплексных мер по борьбе качества, так что, когда это сделано должным образом, этот метод может дать ценную информацию о сравнительных длину теломер. Кроме того, этот метод был адаптирован для использования вне лейкоцитов для измерениядлина теломер в различных тканях ^42.

Кроме того, в целях более глубокого понимания биологии за длину теломер и взаимодействия между двумя противоположными эффектами (то есть укорочение теломер во время репликации и удлинения фермент теломераза), мы сопровождали длины теломер методом с дополнительным анализом, который измеряет активность теломеразы.

Для этой цели мы использовали протокол амплификации теломерных Повтор, Анализ in vitro. Вкратце, лизируют сохранена, ферментативно активной клетки синтезировали теломерных повторов на подложку с использованием олигонуклеотидных теломеразы, и продукты были амплифицированы с помощью ПЦР в присутствии SYBR Green. Затем результаты были проанализированы путем сравнения образцов и контрольных значений Ct порога. Так как теломераза теплочувствительную фермента, дополнительные термообработке управления запуске рядом друг с образцом ^21.

<p class="Jove_content"> При измерении длины теломеров может предоставить ценную информацию о возможной роли длину теломер в патофизиологии старения и болезней, длина теломер не статическое свойство и больше информации, необходимой для понимания функции теломер. Исследования Активность теломеразы может добавить информацию о механизмах регулирования теломер длины. Например, управления активацией теломеразы может поддерживать длину теломер и клеточную пролиферацию, но неконтролируемой активации теломеразы может привести к раку. Эти два недорогих и прямой методы в сочетании предоставили нам не только к более убедительные доказательства взаимосвязи между длиной теломер и клеточной стабильности, но и более глубокое представление о возможных механизмах укорочение теломер и восстановления. С помощью этих методов мы надеемся и далее выяснить реакцию клетки к старению и различные состояния клеточной пролиферации с конечной целью лучшего понимания центральной mechanisMS клеточной биологии.

Protocol

1. Протокол теломер Длина 19 Выделение ДНК Большинство методов выделения ДНК может быть использован. Наша лаборатория предпочитает Qiagen DNeasy Kit (# 69506) для крови источников. В зависимости от источника ДНК, например, буккального или других источников, другой спо…

Representative Results

Пример длину теломер QRT-PCR анализа показан на рисунке 1. В левой верхней части панели, образцы помечены красным и зеленым представлять расположение предметов протестированы на 96-луночный планшет. В правом верхнем углу панели, кривой усиления демонстрируется. Каждый предмет про…

Discussion

Длина теломер предоставляет уникальный клеточный маркер для изучения напряженно и старения клеток и предлагает взглянуть на механизмы старения. Так как его роль в старении впервые было предложено, множество исследований было сделано, касающиеся длины теломеров с возрастом, долголет?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Quantitative Telomerase Detection	Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy Kit	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument	Roche Diagnostics	4707516