رصد هجرة الخلايا الجذعية باستخدام<sup> 19</sup> F /<sup> 1</sup> H التصوير بالرنين المغناطيسي
Summary
وقد اكتسب تتبع من الخلايا باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي اهتمام ملحوظا في السنوات الماضية. يصف هذا البروتوكول بوضع العلامات على الخلايا الجذعية مع الفلور (<sup> 19</sup> جزيئات F) الغنية، وتطبيق في الجسم الحي من هذه الخلايا، ورصد مدى هجرتهم إلى العقدة الليمفاوية استنزاف مع<sup> 19</sup> F /<sup> 1</sup> H التصوير بالرنين المغناطيسي و<sup> 19</sup> F MRS.
Abstract
التقدم المستمر في طرائق التصوير موسع مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) قد تحسنت بشكل كبير قدرتنا على دراسة العمليات الفيزيولوجية المرضية أو في الكائنات الحية. التصوير بالرنين المغناطيسي يثبت أيضا أن يكون أداة قيمة لالتقاط الخلايا التي تم زرعها في الجسم الحي. استراتيجيات التوسيم الخلية الأولي للتصوير بالرنين المغناطيسي استخدام مصنوعة من عوامل التباين التي تؤثر في اوقات الاسترخاء MR (T1، T2، T2 *) ويؤدي إلى تعزيز (T1) أو نضوب (T2 *) من إشارة حيث الخلايا المسمى موجودة. T2 * وكلاء تعزيز مثل الصغر وكلاء أكسيد الحديد (USPIO) وقد استخدمت لدراسة الهجرة الخلية والبعض أيضا قد وافقت عليه ادارة الاغذية والعقاقير لالتطبيق السريري. والعيب من T2 * وكلاء هو صعوبة التمييز بين الانقراض إشارة إنشاؤها بواسطة الخلايا المسمى من التحف الأخرى مثل جلطات الدم، نزيف الدقيقة أو فقاعات الهواء. في هذه المقالة، ونحن تصف تقنية ناشئة لخلايا الجسم الحي تتبع في ذلكويستند على وصفها الخلايا مع الفلور (F 19) الغنية الجسيمات. وتعد هذه الجسيمات عن طريق الاستحلاب المشبعة (PFC) مركبات وتستخدم بعد ذلك إلى خلايا التسمية، التي لاحقا يمكن تصوير بنسبة 19 F التصوير بالرنين المغناطيسي. مزايا هامة من الهيدروكربون المشبع بالفلور لتتبع خلية في الجسم الحي ما يلي: (ط) عدم وجود الكربون محدد 19 F في الجسم الحي والتي ينتج عنها بعد ذلك خالية من الصور الخلفية وكاملة خلية selectivityand (II) إمكانية لقياس إشارة الخلية بنسبة 19 F MR الطيفي .
Introduction
تتبع من الخلايا في الجسم الحي هو جانب هام في عدة مجالات الطب الحيوي. لهذا، وتقنيات التصوير موسع التي يمكن توطين بشكل انتقائي خلايا على مدى فترة من الوقت هي قيمة للغاية. قبل وضع ثلاثي الأبعاد التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، تتبع هجرة الخلايا المناعية اقتصر على التحليلات المجهرية أو الخزعات النسيجية. وقد اكتسب تتبع الخلية بمساعدة التصوير بالرنين المغناطيسي الاهتمام هائلة في السنوات القليلة الماضية، ليس فقط بالنسبة للمناعة دراسة سلوك الخلايا المناعية في الجسم الحي، ولكن أيضا للباحثين الخلية الجذعية السريرية و. خلال منتصف 90s، أولى الدراسات على أكسيد الحديد النانوية 1 شرعت في سلسلة من التطورات لخلايا تتبع مع التصوير بالرنين المغناطيسي. جسيمات أكسيد الحديد تقصير وقت الاسترخاء MR (T2 *) من الخلايا المسمى وبالتالي تسبب نضوب إشارة في صور الرنين المغناطيسي. وقد استخدمت جسيمات أكسيد الحديد لالضامة التسمية 2، ص دبقية قليلة التغصنrogenitors 3 والعديد من أنواع الخلايا الأخرى. كما تم الموافقة سريريا بعض هذه الجسيمات من قبل ادارة الاغذية والعقاقير لوصفها اللقاحات الخلوية في مرضى سرطان الجلد 4. منذ ذلك الحين في الجسم الحي أو وضع العلامات فيفو السابقين الخلايا مع جزيئات أكسيد الحديد تعتمد على تقصير من * إشارة T2 ويمكن رفع هذا الأخير أيضا حول من قبل في الجسم الحي المتصلة قابلية T2 * تأثيرات مثل ينزف الصغرى، رواسب الحديد أو فقاعات الهواء، قد يكون من الصعب تحديد الخلايا المسمى في الجسم الحي من خلفية أخرى T2 * انقراض إشارة 5.
في هذه المقالة، ونحن تصف تقنية لتتبع الخلايا الجذعية (DC) في الجسم الحي من خلال توظيف 19 F / 1 H التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). وقدم هذه التكنولوجيا تتبع الخلية فقط في عام 2005 6، وبعد عدة سنوات من تطبيقات أقر لأول مرة لمدة 19 F في التصوير بالرنين المغناطيسي قد تم الإبلاغ عن 7. واحدة أدفا هامةntage من 19 F أكثر من أكسيد الحديد الجسيمات وسم الخلية هو وقوع البيولوجي منخفض من 19 F في الأنسجة، وهذا يجعل من الممكن لتعقب الخلايا بشكل انتقائي جدا مع الصور مجانا خلفية أساسا. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن أن تراكب 19 F MR إشارة من الخلايا المسمى المزروعة مع الصور التشريحية التقليدية 1H تم الحصول عليها من التصوير بالرنين المغناطيسي. 19 F / 1 H التصوير بالرنين المغناطيسي هو بالتالي ذات الصلة إلى حد كبير لدراسات الهجرة التحقيق خلية في الجسم الحي. وصفت الخلايا درس مع هذا الأسلوب مع 19 الجزيئات F الغنية. المشبعة صناعيا المستمدة بالفلور التي تتكون أساسا من الكربون وذرات الفلور وتستخدم عادة لتحضير جسيمات. هذه المركبات هي غير قابلة للذوبان في الماء، وتحتاج إلى مستحلب قبل تطبيق في المختبر أو في الجسم الحي. حجم المعتاد للجسيمات PFC التي استخدمت من قبل مجموعات أخرى لفي الجسم الحي 19 التجارب تتبع F-MRIيتراوح بين 100 نانومتر و 245 نانومتر 6،8-10. ومع ذلك أظهرنا أن كفاءة في وسم الخلايا الجذعية مع perfluoro-15-تاج-5-الأثير (PFCE) زيادات جزيئات مع زيادة حجم الجسيمات (> 560 نانومتر). 11
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه الطريقة في توظيف 19 F / 1 H التصوير بالرنين المغناطيسي لمتابعة حركة العاصمة إلى العقدة الليمفاوية يعطي الفرصة لدراسة أنماط هجرة الخلايا المناعية في الجسم الحي. الخلايا الجذعية هي أمثلة ممتازة للهجرة بسرعة الخلايا المناعية التي تكون قادرة على المنا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل جمعية الألمانية للبحوث إلى SW (DFG WA 2804) ومنحة الجامعة لSW من مركز البحوث التجريبية والسريرية، وبالتعاون مع مركز ماكس للطب الجزيئي وشاريتيه في برلين كلية الطب ديلبروك. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة. نشكر السيد روبرت يستفال للحصول على الدعم الفني خلال التدريب له في مختبرنا.
Materials
| REAGENTS | |||
| C57BL/6 mice | Charles River, Berlin | ||
| RPMI | Gibco | 21875-091 | |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 | |
| HEPES | Gibco-Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| PFA | Santa Cruz | sc-281692 | |
| Perfluoro-15-crown-5-ether | ChemPur | 391-1996 | |
| Pluronic F-68 | Sigma Aldrich | P5556 | |
| Petri dishes (35 x 10 mm) | VWR, Germany | 391-1996 | |
| 27 ½ G syringes | VWR, Germany | 612-0151 | |
| Nylon cell strainers (100 μm mesh) | VWR, Germany | 734-0004 | |
| NMR tubes | VWR, Germany | 634-0461 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dissection tools | FST | ||
| CO2 incubator | Binder | ||
| Small animal MR system | Bruker Biospin | 9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software | |
| 1H/19F dual-tunable volume RF coil | Rapid Biomed, Würzburg, Germany | 35 mm inner diameter, 50 mm length | |
| 19F spectroscopy coil | in-house | tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching | |
| Isoflurane inhalation system | Föhr Medical Instruments GmbH | ||
| Animal monitoring system Model 1025 | SA Instruments Inc., New York, USA |
References
- Yeh, T. C., Zhang, W., Ildstad, S. T., Ho, C. In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles. Magn. Reson. Med. 33 (2), 200-208 (1995).
- Weissleder, R., Cheng, H. C., Bogdanova, A., Bogdanov, A. Magnetically labeled cells can be detected by MR imaging. J. Magn. Reson. Imaging. 7 (1), 258-263 (1997).
- Franklin, R. J., Blaschuk, K. L., Bearchell, M. C., Prestoz, L. L., Setzu, A., et al. Magnetic resonance imaging of transplanted oligodendrocyte precursors in the rat brain. NeuroReport. 10 (18), 3961-3965 (1999).
- de Vries, I. J., Lesterhuis, W. J., Barentsz, J. O., Verdijk, P., van Krieken, J. H., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nat. Biotechnol. 23 (11), 1407-1413 (2005).
- Liu, W., Frank, J. A. Detection and quantification of magnetically labeled cells by cellular MRI. Eur. J. Radiol. 70 (2), 258-264 (2009).
- Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells. Nat. Biotechnol. 23 (8), 983-987 (2005).
- Holland, G. N., Bottomley, P. A., Hinshaw, W. S. F-19 Magnetic-Resonance Imaging. Journal of Magnetic Resonance. 28 (1), 133-136 (1977).
- Partlow, K. C., Chen, J., Brant, J. A., Neubauer, A. M., Meyerrose, T. E., et al. 19F magnetic resonance imaging for stem/progenitor cell tracking with multiple unique perfluorocarbon nanobeacons. FASEB J. 21 (8), 1647-1654 (2007).
- Ruiz-Cabello, J., Walczak, P., Kedziorek, D. A., Chacko, V. P., Schmieder, A. H., et al. In vivo “hot spot” MR imaging of neural stem cells using fluorinated nanoparticles. Magn. Reson. Med. 60 (6), 1506-1511 (2008).
- Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model. Magn. Reson. Med. 58 (4), 725-734 (2007).
- Waiczies, H., Lepore, S., Janitzek, N., Hagen, U., Seifert, F., et al. Perfluorocarbon particle size influences magnetic resonance signal and immunological properties of dendritic cells. PLoS ONE. 6 (7), e21981 (2011).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging. J. Vis. Exp. (17), e773 (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lanzavecchia, A., Sallusto, F. Ralph M. Steinman. 1943-2011. Cell. 147 (6), 1216-1217 (1943).
- Srinivas, M., Turner, M. S., Janjic, J. M., Morel, P. A., Laidlaw, D. H., et al. In vivo cytometry of antigen-specific t cells using 19F. MRI. Magn. Reson. Med. 62 (3), 747-753 (2009).
- Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. (19)F MRI for quantitative in vivo cell tracking. Trends Biotechnol. 28 (7), 363-370 (2010).
- Lammermann, T., Bader, B. L., Monkley, S. J., Worbs, T., Wedlich-Soldner, R., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Liu, M. S., Long, D. M. Perfluoroctylbromide as a diagnostic contrast medium in gastroenterography. Radiology. 122 (1), 71-76 (1977).
- Kwiatkowska, K., Sobota, A. Signaling pathways in phagocytosis. Bioessays. 21 (5), 422-431 (1999).
- Mitragotri, S., Lahann, J. Physical approaches to biomaterial design. Nat. Mater. 8 (1), 15-23 (2009).
- Hoult, D. I., Richards, R. E. The signal-to-noise ratio of the nuclear magnetic resonance experiment. J. Magn. Reson. 24 (1), 71-85 (1976).
- Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. Cryogenically cooled probes – a leap in NMR technology. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).
- Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy. PLoS ONE. 7 (3), e32796 (2012).
- Haacke, E. M. . Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design. , (1999).
