अलग तैयारी से भ्रूण और लार्वा zebrafish कंकाल myofibers का विश्लेषण
Summary
Zebrafish कंकाल की मांसपेशी के मानव विकारों मॉडलिंग के लिए एक उभरती हुई व्यवस्था कर रहे हैं. हम भ्रूण और लार्वा zebrafish से कंकाल की मांसपेशी myofibers अलग करने के लिए एक तेज और कुशल विधि का वर्णन. यह विधि एक ही कंकाल की मांसपेशी फाइबर आकृति विज्ञान के अध्ययन के लिए उपयुक्त उच्च घनत्व myofiber तैयारी, प्रोटीन subcellular स्थानीयकरण, और मांसपेशियों शरीर विज्ञान पैदावार.
Abstract
zebrafish कंकाल की मांसपेशी समारोह की खोज के लिए और मानव मांसपेशियों की बीमारियों के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली साबित हो गया है. विशेष रूप से पूरे भ्रूण में, मांसपेशी समारोह के लिए जिम्मेदार जटिल और पतले संरचित प्रोटीन परिवेश visualizing, zebrafish में कंकाल की मांसपेशी के vivo विश्लेषण द्वारा की पेशकश कई फायदे के बावजूद, समस्याग्रस्त किया जा सकता. इस बाधा zebrafish कंकाल की मांसपेशी (60 माइक्रोन) और sarcomere के भी छोटे आकार का छोटे आकार की वजह से उपजी. यहाँ हम का वर्णन है और zebrafish भ्रूण और लार्वा से कंकाल myofibers अलग करने के लिए एक सरल और तेजी से विधि प्रदर्शित करता है. हम यह भी मांसपेशियों संरचना और समारोह का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी पोस्ट तैयार करने की तकनीक है कि वर्णन प्रोटोकॉल शामिल हैं. विशेष रूप से, हम विस्तार से कंकाल की मांसपेशी प्रोटीन के बाद immunocytochemical स्थानीयकरण और लाइव सेल कैल्शियम इमेजिंग के माध्यम से प्रेरित कैल्शियम रिहाई के गुणात्मक विश्लेषण. कुल मिलाकर, इस वीडियोलेख zebrafish कंकाल myofibers के अलगाव और लक्षण, मांसपेशी संरचना और समारोह के असंख्य बाद के अध्ययन के लिए एक नाली प्रदान करता है जो एक तकनीक के लिए एक सीधे आगे और कारगर तरीका प्रदान करता है.
Introduction
कंकाल की मांसपेशी गतिशीलता के लिए आवश्यक सिकुड़ा बलों पैदा करने के लिए जिम्मेदार एक अति विशिष्ट ऊतक है. संकुचन intracellular दुकानों 1,2 से कैल्शियम रिहाई के लिए विद्युत संकेतों को धर्मान्तरित कि उत्तेजना संकुचन (ईसी) युग्मन के रूप में जाना जाता प्रक्रिया के माध्यम से शुरू की है. Intracellular कैल्शियम रिहाई बल छोटा और उत्पन्न करने के लिए sarcomere सक्रिय. neuromuscular जंक्शन प्रसारण 3, चुनाव आयोग युग्मन 4,5, और actin-मायोसिन निर्भर संकुचन 6 मध्यस्थता के लिए जिम्मेदार आणविक मशीनरी के कई विशिष्ट घटकों को गहन अनुसंधान के चल रहे विषय बने हुए हैं. इसके अलावा, संकुचन 7,8 और myofiber और बाह्य मैट्रिक्स 7,9 के बीच संकेत है कि मध्यस्थता के दौरान मांसपेशियों झिल्ली को स्थिर प्रोटीन है कि पहचान की गई है और महान विस्तार से अध्ययन किया.
मांसपेशियों संरचना एक के लिए महत्वपूर्ण जीनों के एक नंबर में उत्परिवर्तनएन डी समारोह (मानव कंकाल मांसपेशियों की बीमारियों का कारण के रूप में पहचान की गई है http://www.musclegenetable.org/ ). नैदानिक और histopathologic सुविधाओं के आधार पर कंकाल myopathies और पेशी अपविकास के रूप में मोटे तौर पर वर्गीकृत इन रोगों,, मांसपेशियों में कमजोरी, आजीवन विकलांगता, और जल्दी मृत्यु दर 10,11 के साथ जुड़े रहे हैं. zebrafish मानव कंकाल मांसपेशियों की बीमारियों 8,12,13 मॉडलिंग और अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली साबित हो गया है. यह नए जीन म्यूटेशन 8 मान्य रोग pathophysiology 14,15 के नए पहलुओं को परिभाषित है, और नए चिकित्सकीय दृष्टिकोण 15,16 की पहचान करने के लिए नियोजित किया गया है. मानव मांसपेशियों की बीमारी का अध्ययन के लिए zebrafish के सत्ता वंश, मांसपेशियों संरचना और समारोह, zebrafish भ्रूण की ऑप्टिकल स्पष्टता, और विकासशील ज़ेबरा की आनुवंशिक और pharmacologic हेरफेर की आसानी के तेजी से विकास की बड़ी संख्या से संबंधित हैमछली 17.
हम और दूसरों 12,18,19 हाल ही में विकासशील zebrafish से myofibers का तेजी से और कुशल अलगाव के लिए एक सरल तकनीक विकसित की है. इस पद्धति को पूरे भ्रूण विश्लेषण द्वारा प्रदान किया जा सकता है की तुलना में अधिक से अधिक विस्तार में myofibers की परीक्षा के लिए सक्षम है. तकनीक नव विकसित रोग मॉडल 21 में सत्यापन के अध्ययन के हिस्से के रूप में महत्वपूर्ण histopathologic विशेषताओं की पहचान के लिए प्रोटीन subcellular स्थानीयकरण 20 के साथ ही के लक्षण वर्णन के लिए दोहन किया गया है. इसके अलावा, पृथक myofibers साथ ही रहते इमेजिंग के लिए और electrophysiological पढ़ाई 22, मांसपेशी समारोह के महत्वपूर्ण पहलुओं की पूछताछ के लिए अनुमति देते हैं कि तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बाद में विश्लेषणात्मक प्रयोगों के दो उदाहरण के साथ myofiber अलगाव के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल, इस पांडुलिपि के शेष भागों में विस्तृत है.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish विवो 25,27,28 में मांसपेशियों के विकास और समारोह के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली हड्डीवाला मॉडल प्रणाली रहे हैं. उन्होंने यह भी मानव मांसपेशियों की बीमारियों 14,15,20,29 मॉडलिंग के लिए एक मूल्यव?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों तकनीक के विकास के लिए और पांडुलिपि के उत्पादन के लिए योगदान दिया है कि दोव्लिंग प्रयोगशाला के सदस्यों (हारून Reifler, ट्रेंट वॉ, एंजेला गाया, और विलियम Telfer) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम Taubman संस्थान, मिशिगन विश्वविद्यालय में बाल रोग विभाग, और पेशी Dystrophy एसोसिएशन (JJD MDA186999) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (JJD 1K08AR054835) से अनुदान से भाग में द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
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