Analyse van de embryonale en larvale zebravis Skeletal myovezels van Gedissocieerde Voorbereidingen
Summary
Zebravis zijn een opkomende systeem voor het modelleren van menselijke aandoeningen van de skeletspieren. We beschrijven een snelle en efficiënte methode om skeletspier myovezels isoleren van embryonale en larvale zebravis. Deze methode levert een high-density myofiber voorbereiding geschikt voor onderzoek met een enkelvoudige skeletspieren vezelmorfologie, eiwit lokalisatie, en spier-fysiologie.
Abstract
De zebravis heeft zich bewezen als een waardevol model systeem voor het verkennen van de skeletspier functie en voor het bestuderen van menselijke spierziekten. Ondanks de vele voordelen van in vivo analyse van de skeletspier bij de zebravis, visualiseren het complex en fijn gestructureerde eiwitten milieu belast spierfunctie, vooral gehele embryo, kan problematisch zijn. Deze belemmering vloeit voort uit de geringe omvang van de zebravis skeletspieren (60 micrometer) en de nog kleinere omvang van de sarcomeer. Hier beschrijven we en demonstreren van een eenvoudige en snelle methode voor het isoleren van het skelet myovezels van zebravis embryo's en larven. We hebben ook protocollen die post voorbereiding technieken bruikbaar voor het analyseren van de spier structuur en functie te illustreren. Concreet, we detail de daaropvolgende immunocytochemische lokalisatie van de skeletspieren eiwitten en de kwalitatieve analyse van de gestimuleerde calcium vrijstelling via live cell imaging calcium. Over het algemeen, deze videoartikel geeft een ongecompliceerde en efficiënte methode voor het isoleren en karakteriseren van zebravis skelet myofibers, een techniek die een groot kanaal voor verdere studies spier structuur en functie verschaft.
Introduction
Skeletspier is een zeer gespecialiseerde weefsel verantwoordelijk zijn voor het genereren van de contractiele krachten die nodig zijn voor de beweeglijkheid. Contractie wordt geïnitieerd via een proces dat bekend staat als excitatie-contractie (EC) koppeling die elektrische signalen omzet naar calcium vrijlating uit intracellulaire opslagplaatsen 1,2. Intracellulair calcium vrijlating activeert de sarcomeer in te korten en het genereren van kracht. De vele specifieke onderdelen van de moleculaire machines die verantwoordelijk is voor het bemiddelen neuromusculaire verbinding transmissie 3, EG-koppeling 4,5, en actine-myosine afhankelijke contracties 6 blijven de lopende onderwerp van intensief onderzoek. Bovendien zijn eiwitten die de spier membraan stabiliseren tijdens contractie 7,8 en bemiddelde signalering tussen de myofiber en de extracellulaire matrix 7,9 geïdentificeerd en onderzocht in detail.
Mutaties in verschillende genen betrokken spierstructuur eennd functie zijn geïdentificeerd als oorzaken van menselijke skeletspier ziekten ( http://www.musclegenetable.org/ ). Deze ziekten, in grote lijnen ingedeeld als skelet myopathieën en spierdystrofieën gebaseerd op klinische en histopathologische kenmerken, worden geassocieerd met spierzwakte, levenslange handicap, en vroege sterfte 10,11. De zebravis heeft zich bewezen als een uitstekend systeem voor het modelleren en de studie van de menselijke skeletspier ziekten 8,12,13 zijn. Het is aangewend om nieuwe genmutaties 8 valideren, definiëren van nieuwe aspecten van de ziekte pathofysiologie 14,15, en nieuwe therapeutische benaderingen 15,16. De kracht van de zebravis voor het bestuderen van humane spierziekte betreft het groot aantal nakomelingen, de snelle ontwikkeling van spieren structuur en functie, de optische helderheid van het zebravis embryo, en het gemak van genetische en farmacologische manipulatie van de ontwikkeling zebravis 17.
Wij en anderen 12,18,19 hebben onlangs een eenvoudige techniek voor snelle en efficiënte isolatie van spiervezels van de zebravisembryo. Deze methode heeft het onderzoek van spiervezels mogelijk gedetailleerder dan kan worden verschaft door gehele embryo analyse. De techniek is benut voor het karakteriseren van eiwitten subcellulaire lokalisatie 20 en voor de belangrijke histopathologische kenmerken kader van valideringsonderzoeken nieuw ontwikkelde ziektemodellen 21. Bovendien kan geïsoleerde myovezels bovendien worden gebruikt voor live beeldvorming en voor elektrofysiologische studies 22, technieken die het mogelijk maken voor de ondervraging van de belangrijkste aspecten van de spierfunctie. De specifieke protocol voor myofiber isolatie, samen met twee voorbeelden van latere analytische experimenten, wordt gedetailleerd beschreven in de overige delen van dit manuscript.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebravis zijn een krachtig gewerveld modelsysteem voor het bestuderen spierontwikkeling en functie in vivo 25,27,28. Ze hebben ook naar voren gekomen als een waardevolle aanwinst voor het modelleren van de menselijke spierziekten 14,15,20,29. Terwijl grote stappen zijn genomen om het gebruik en de toepassing van de zebravis voor de studie van de spierfunctie en spierziekte te bevorderen, is er een constante kritieke behoefte aan tools die meer diepgaande analyse die de genetische, morfolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de leden van de Dowling lab (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, en William Telfer) die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van de techniek en de productie van het manuscript bedanken. Dit werk werd gefinancierd door de Taubman Instituut, de afdeling Kindergeneeskunde aan de Universiteit van Michigan, en voor een deel uit subsidies van de Vereniging van de Spierdystrofie (JJD MDA186999) en de National Institutes of Health (JJD 1K08AR054835).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
References
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling. J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).
- Ohno, K. Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction. Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).
- Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
- Sparrow, J. C., Schock, F. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Barresi, R., Campbell, K. P. Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease. J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).
- Emery, A. E. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey. Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).
- Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. Congenital myopathies: an update. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).
- Bassett, D. I., Currie, P. D. The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy. Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).
- Dowling, J. J., et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5, (2009).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).
- Detrich, H. W., Westerfield, M., M, L. I., Zon, Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Nixon, S. J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).
- Schredelseker, J., et al. The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy. Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).
- Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit. J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhou, W., et al. Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants. Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).
- Hirata, H., et al. accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1. Development. 131, 5457-5468 (2004).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).
- Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres. J. Physiol. 564, 451-464 (2005).
- Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs. Nature. 346, (1990).
- Sakowski, S. A., et al. A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture. J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).
- Nakano, Y., et al. Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation. Development. 137, 1689-1698 (2010).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).
