הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית
Summary
אנו מציגים שיטת סינון מהירה וזולה לזיהוי רגולטורים תעתיק באמצעות transfections רובוטית תפוקה גבוהה וassay בלוציפראז כפול זוהר תוצרת בית. פרוטוקול זה במהירות מייצר נתונים פונקציונליים Side-by-צד ישיר לאלפי גנים והוא שינוי בקלות למקד כל גן של עניין.
Abstract
אנו מציגים פרוטוקול תפוקה גבוהה הקרנה מהירה וזול לזיהוי רגולטורים תעתיק של synuclein אלפא, גן הקשור למחלה פרקינסון. תאי 293T הם transfected transiently עם פלסמידים מספריית ביטוי ORF ערוך, יחד עם פלסמידים כתב בלוציפראז, בפורמט microplate אחד של גן לכל כן. פעילות גחלילית בלוציפראז היא assayed לאחר 48 שעה כדי לקבוע את ההשפעות של כל גן ספרייה על שעתוק synuclein אלפא, מנורמל לביטוי ממבנה בקרה פנימי (אמרגן HCMV בימוי לוציפראז Renilla). פרוטוקול זה הוא הקל על ידי רובוט ספסל העליון הסגור בארון בטיחות ביולוגי, אשר מבצע טיפול נוזל מזוהם בפורמט 96 היטב. פרוטוקול transfection האוטומטי שלנו הוא בקלות להתאמה לייצור ספריית lentiviral תפוקה גבוהה או פרוטוקולי הקרנה פונקציונליים אחרים הדורשים משולש transfections של מספר הגדול של פלסמידים ספרייה ייחודיים בconjunction עם סט משותף של פלסמידים עוזר. אנו מציגים גם חלופה זולה ומאומתים לחומרים כימיים, זמינים מסחרי, כפולים לוציפראז המעסיק PTC124, EDTA, וpyrophosphate לדכא פעילות גחלילית לוציפראז לפני המדידה של לוציפראז Renilla. שימוש בשיטות אלה, אנו הוקרנו 7670 הגנים אנושיים וזיהינו 68 רגולטורים של אלפא סינוקלאין. פרוטוקול זה הוא שינוי בקלות למקד גנים אחרים של עניין.
Introduction
היכולת לזהות מרכיבים עיקריים גנטיים רגולציה וגורמים הפועלים עליהם היא יסוד לחקר של תהליכים ביולוגיים רבים. עם זאת, זיהוי גורמים המווסתים את הביטוי של גנים בסוגי תאים נדירים, כגון אוכלוסיות עצביות ספציפיות, יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי רגולטורים תעתיק רומן של synuclein אלפא (אס.אנ.סי. איי), גן הקשור למחלת פרקינסון, והביע בנוירונים דופאמין בsubstantianigra PARS אזור compacta של המוח התיכון. אנו משיגים זאת באמצעות מסך כתב תפוקה גבוהה, כפול לוציפראז, במבחנה כדי לפרק ביטוי אלפא סינוקלאין בתאי 293T. אמרגן אלפא סינוקלאין הוא משובט ראשון לתוך פלסמיד כתב המכיל את גן גחלילית בלוציפראז. פלסמיד זמין מסחרי המכיל את לוציפראז Renilla תחת השליטה של אמרגן פעיל constitutively משמש כבקרה פנימית. Thesכתב בונה דואר היא שיתוף transfected לתוך תאי 293T בmicroplates עם פלסמידים מספריית ביטוי ה-DNA, כך שכל אחד גם הוא transfected עם פלסמיד ספרייה אחת. לאחר 48 שעה, פעילות לוציפראז עבור כל כתב נמדדה ברצף באמצעות assay כפול זוהר. הביטוי היחסי של אלפא סינוקלאין בתגובה לכל גן ספרייה הוא להסיק לפי היחס של גחלילית: פעילות Renilla לוציפראז בכל טוב (F: יחס R) לאחר נורמליזציה מבוססת צלחת.
פרוטוקול זה מספק את יכולת מסך מספר רב של גנים (~ 2,500 בשבוע) ביכולתם transactivate גן כתב באמצעות כוח אדם מינימאלי (1-2 אנשים) ובעלות מינימאלית (כ -3 דולרי עלות מגיב לכל assay microplate). רגולטורים תעתיק של גנים עצביים (למשל, synuclein אלפא), שקשה ללמוד בנוירונים בתרבית עקשן למניפולציה גנטית, ניתן להשוות Side-by-צד בassay הפונקציונלי ישיר זה. אנו כוללים בנופרוטוקול מפורט שיטה לשכפול ולצמיחה של פלסמידים המכילים את אמרגן synuclein אלפא, שכן מצאנו כי פלסמידים המכילים אזור זה הם לא יציבים כאשר גדלו עם נהלים מקובלים (ראה דיון). אנו גם חלופה זולה לחומרים כימיים הכפול לוציפראז זמינים מסחרי עבור מבחני תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות למקד אלמנטים רגולטוריים נוספים של ריבית, או לכל תהליך הדורש transfections החולף תפוקה גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
אלפא סינוקלאין היה מעורב במחלת פרקינסון (PD) כמרכיב של גופי לוי 4, תכלילים תאיים נחשבים pathognomonic למחלה. מחקרי עמותה הגנום רבים מצאו קשר בין פולימורפיזם של נוקלאוטיד יחיד בsynuclein אלפא עם סיכון מוגבר לספורדיים פ"ד 5,6,7. אמנם פחות נפוצה מאשר פ"ד סדיר, פ"ד המש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לג'ון דרגה של MGH-DNA Core להכנת ספריית הקרנת ה-DNA. כריסטופר Chigas של פרקין אלמר סיפק תמיכה לא יסולא בפז עבור luminometer Wallac 1420 שלנו. סטיבן Ciacco ומרטין תומא של Agilent סיפקו תמיכה לרובוט בראבו. אנו מודים רון ג'ונסון וסטיב טיטוס בNIH לנדיבות מתן פרוטוקול assay בלוציפראז כפול זוהר שלהם.
Materials
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | – | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| Coenzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 |
References
- Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).
- Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113 (5), 426-431 (2003).
- Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson’s disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
- Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson’s disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease. Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).
- Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson’s disease. Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).
- Chartier-Harlin, M. -. C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson’s disease. Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).
- Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson’s disease. Science. 302 (5646), 841 (2003).
- Ahn, T. -. B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
- Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
- Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).
- Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).
- Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).
- Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).
