High-throughput screening funzionale utilizzando una casalinga Dual-glow Luciferase Assay
Summary
Vi presentiamo un metodo di screening rapido e poco costoso per identificare regolatori trascrizionali utilizzando high-throughput transfezioni robotici e un dual-bagliore saggio di luciferasi in casa. Questo protocollo genera rapidamente dati scalo side-by-side funzionali per migliaia di geni ed è facilmente modificabile per indirizzare qualsiasi gene di interesse.
Abstract
Vi presentiamo un protocollo di screening high-throughput rapido e poco costoso per identificare i regolatori trascrizionali di alfa-sinucleina, un gene associato alla malattia di Parkinson. Cellule 293T sono transitoriamente trasfettate con plasmidi di una libreria di espressione ORF schierati, insieme con plasmidi reporter luciferasi, in un formato micropiastra un gene-per-bene. Attività di luciferasi di lucciola è analizzato dopo 48 ore per determinare gli effetti di ogni gene biblioteca upon alfasinucleina trascrizione, normalizzata a espressione da un costrutto di controllo interno (promotore hCMV dirigere Renilla luciferasi). Questo protocollo è facilitato da un robot banco racchiuso in un armadio biosicurezza, che esegue la movimentazione liquido asettico in formato a 96 pozzetti. Il nostro protocollo di trasfezione automatizzato è facilmente adattabile a high-throughput produzione biblioteca lentivirali o altri protocolli di screening funzionali che richiedono triple-transfezioni di un gran numero di plasmidi biblioteca unica nel coniugatonction con un insieme comune di plasmidi helper. Presentiamo anche un'alternativa economica e validato per disponibili in commercio, doppio reagenti luciferasi che impiega PTC124, EDTA, e pirofosfato di sopprimere l'attività luciferasi di lucciola prima della misura di Renilla luciferasi. L'utilizzo di questi metodi, abbiamo proiettato 7670 geni umani e identificato 68 regolatori di alfa-sinucleina. Questo protocollo è facilmente modificabile per indirizzare altri geni di interesse.
Introduction
La capacità di identificare i principali elementi regolatori genetici ed i fattori che agiscono su di essi è fondamentale per l'esplorazione di numerosi processi biologici. Tuttavia, identificando i fattori che regolano l'espressione dei geni in tipi di cellule rare, come specifiche popolazioni di neuroni, può essere impegnativo. Qui vi presentiamo un protocollo per identificare nuovi regolatori trascrizionali di alfa-sinucleina (SNCA), un gene associato con la malattia di Parkinson ed espresso nei neuroni dopaminergici nella substantianigra pars compacta regione del mesencefalo. Compiamo questo utilizzando uno schermo giornalista high-throughput, dual-luciferasi, in vitro decostruire l'espressione di alfa-sinucleina in cellule 293T. Il promotore alfasinucleina viene clonato in un plasmide contenente il gene reporter di luciferasi di lucciola. Un plasmide disponibile in commercio, contenente la luciferasi Renilla sotto il controllo di un promotore costitutivamente attivo serve come controllo interno. Thescostrutti e giornalista sono co-trasfettati in cellule 293T in micropiastre con plasmidi da una libreria di espressione del DNA, in modo che ogni bene è trasfettate con una singola libreria plasmide. Dopo 48 ore, l'attività della luciferasi per ogni giornalista è misurata in sequenza usando un test a doppio bagliore. L'espressione relativa di alfa-sinucleina in risposta a ciascun gene libreria viene dedotto dal rapporto di lucciola: attività di luciferasi Renilla in ciascun pozzetto (F: rapporto R) dopo normalizzazione basato piastra.
Questo protocollo consente di schermare un gran numero di geni (~ 2,500 a settimana) per la loro capacità di transattivare un gene reporter utilizzando manodopera minima (1-2 persone) e un costo minimo (circa $ 3 costo reagente per test micropiastra). Regolatori trascrizionali di geni neuronali (ad esempio, alfa-sinucleina), che sono difficili da studiare in neuroni in coltura refrattari alla manipolazione genetica, possono essere confrontati side-by-side in questo saggio funzionale diretta. Noi includiamo nel nostroprotocollo un metodo dettagliato per la clonazione e la crescita dei plasmidi contenenti il promotore alfa-sinucleina, poiché abbiamo scoperto che i plasmidi contenenti questa regione sono instabile quando cresciuta con procedure convenzionali (vedi Discussione). Abbiamo anche un'alternativa economica per i reagenti disponibili in commercio dual-luciferasi per saggi high-throughput. Questo protocollo può essere facilmente adattato per indirizzare altri elementi regolatori di interesse, o su qualsiasi processo che richiede alto throughput trasfezioni transitorie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alfasinucleina è stato implicato nel morbo di Parkinson (PD) come componente di corpi di Lewy 4, inclusioni intracellulari considerati patognomonici per la malattia. Numerosi studi di associazione genome-wide hanno collegato polimorfismi a singolo nucleotide in alfa-sinucleina con aumentato rischio di sporadici PD 5,6,7. Sebbene meno comune rispetto sporadici PD, PD familiare può essere causato anche da mutazioni nel alfa-sinucleina 8, così come la duplicazione e triplicazione della a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Giovanni Darga del DNA Nucleo MGH per la preparazione della biblioteca di screening del DNA. Christopher Chigas di Perkin Elmer ha fornito il supporto prezioso per la nostra Wallac 1420 luminometro. Steven Ciacco e Martin Thomae di Agilent fornito il supporto per il robot Bravo. Ringraziamo Ron Johnson e Steve Tito presso il NIH di generosità fornendo il loro protocollo del saggio di luciferasi dual-bagliore.
Materials
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | – | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| Coenzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 |
References
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