自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング
Summary
我々は、高スループットのロボットのトランスフェクションと自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを使用して転写調節因子を同定するための迅速で安価なスクリーニング法を提示する。このプロトコルは、急速に数千の遺伝子のための直接のサイド·バイ·サイド機能データを生成し、目的の任意の遺伝子をターゲットに簡単に変更可能です。
Abstract
我々は、α-シヌクレイン、パーキンソン病に関連する遺伝子の転写調節因子を同定するための迅速かつ安価なハイスループットスクリーニングプロトコルを提示する。 293T細胞を一過一遺伝子あたりウェルマイクロプレートフォーマットで、一緒にルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて、配列されたORFの発現ライブラリー由来のプラスミドでトランスフェクトされる。ホタルルシフェラーゼ活性は、内部コントロール構築物（ ウミシイタケルシフェラーゼを導くhCMVプロモーター）から発現に対して正規化し、α-シヌクレインの転写時に各ライブラリー遺伝子の効果を決定するために48時間後にアッセイされる。このプロトコルは、96ウェルフォーマットで無菌の液体処理を行うバイオセーフティキャビネット内に封入卓上型ロボットによって促進される。我々の自動化されたトランスフェクションプロトコールは、ハイスループットレンチウイルスライブラリーの産生又はコンジュユニークなライブラリープラスミドの多数の三重トランスフェクションを必要とする他の機能的スクリーニングプロトコルに容易に適用可能でヘルパープラスミドの共通セットでnction。また、市販の、デュアルルシフェラーゼPTC124を採用している試薬、EDTA、および以前のウミシイタケルシフェラーゼを測定し、ホタルルシフェラーゼ活性を抑制するために、ピロリン酸への安価で検証済みの代替を提示する。これらの方法を用いて、7,670のヒト遺伝子をスクリーニングし、α-シヌクレインの68調節因子を同定した。このプロトコルは、関心のある他の遺伝子を対象とする、容易に変更可能です。
Introduction
キー遺伝子調節要素とそれらに作用する因子を同定する能力は、非常に多くの生物学的プロセスの探査のための基本である。しかしながら、このような特定のニューロン集団のような希少細胞タイプにおいて遺伝子の発現を調節する因子を同定する、挑戦的であることができる。ここでは、α-シヌクレイン（SNCA）の新規な転写調節因子を同定するためのプロトコルを提示し、パーキンソン病に関連し、substantianigraでドーパミン作動性ニューロンに発現している遺伝子は、中脳の緻密領域様部。我々は、293T細胞におけるα-シヌクレイン発現を分解するための高スループット、デュアルルシフェラーゼレポーターインビトロスクリーンを用いてこれを達成する。 α-シヌクレインプロモーターは、第ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドにクローニングする。構成的に活性なプロモーターの制御下でウミシイタケルシフェラーゼを含む市販のプラスミドを内部対照として役立つ。テサロニケ電子レポーター構築物を、各ウェルが単一のライブラリープラスミドでトランスフェクトされるように、DNA発現ライブラリー由来のプラスミドでマイクロプレート中の293T細胞に同時トランスフェクトする。 48時間後、各レポーターのためのルシフェラーゼ活性は、デュアルグローアッセイを用いて順次測定される。プレートベースの正規化後：（R比F）各ウェルのウミシイタケルシフェラーゼ活性：各ライブラリ遺伝子に応じて、α-シヌクレインの相対発現は、ホタルの比によって推定される。
このプロトコルは、最小限の人員（1-2人）と最小のコスト（マイクロプレートアッセイあたり約3ドル試薬コスト）を使用して、レポーター遺伝子をトランスする能力について多数の遺伝子（週〜2500）をスクリーニングする機能を提供します。遺伝子操作に難治培養ニューロンで研究することが困難である神経細胞の遺伝子の転写調節因子（ 例えば 、α-シヌクレイン）は、この直接機能アッセイで並べて比較することができる。私達は私達の中に含まれるプロトコル我々は、従来の手順（説明を参照）で成長させたときに、この領域を含むプラスミドが不安定であることが見出さため、クローニングおよびα-シヌクレインプロモーターを含むプラスミドの増殖のための詳細な方法。また、ハイスループットアッセイ用の市販のデュアルルシフェラーゼ試薬に安価な代替品が挙げられる。このプロトコルは、容易に、または高スループット一過性トランスフェクションを必要とするあらゆるプロセスに関心のある他の調節エレメントを標的とするように適合させることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
α-シヌクレインはレビー小体4、疾患のための考えられる特徴的な細胞内封入体の成分としてのパーキンソン病（PD）に関与している。数々のゲノムワイド関連解析は、散発的なPDの5,6,7リスクの増加とα-シヌクレインに一塩基多型をリンクされています。散発PDよりも一般的であるが、家族性PDはまた、α-シヌクレイン8と同様に、α-シヌクレイン遺伝子座9,10,11、</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、DNAスクリーニングライブラリの調製のためのMGHのDNAコアのジョンDargaに感謝します。パーキンエルマーのクリストファーChigasは、私たちのワラック1420ルミノメーターのための貴重な支援を提供した。スティーブンCiaccoとAgilentのマーティン·トーメはブラボーロボットのためのサポートを提供した。我々は寛大に自分のデュアルグロールシフェラーゼアッセイプロトコルを提供するためのNIHのロン·ジョンソンとスティーブタイタスに感謝します。
Materials
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | – | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| Coenzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 |
References
- Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).
- Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113 (5), 426-431 (2003).
- Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson’s disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
- Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson’s disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease. Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).
- Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson’s disease. Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).
- Chartier-Harlin, M. -. C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson’s disease. Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).
- Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson’s disease. Science. 302 (5646), 841 (2003).
- Ahn, T. -. B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
- Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
- Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).
- Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).
- Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).
- Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).
