Generering af Aligned Functional myocardievæv via microcontact printing
Summary
Dannelsen af linie myocardievæv er en central forudsætning for at tilpasse de seneste fremskridt inden for stamcelle biologi til klinisk nyttige formål. Heri beskrives en microcontact printing fremgangsmåde til præcis regulering af celle-form og funktion. Brug højtoprensede populationer af embryonale stamceller afledt hjerte progenitorer, så genererer vi anisotropisk funktionel myokardievæv.
Abstract
Fremskreden hjertesvigt udgør en stor udækket behandlingsbehov udfordring, som følge af tab af levedygtige og / eller fuldt funktionel hjertemuskelceller. Trods optimal medicinsk behandling, udgør hjertesvigt en førende årsag til sygelighed og dødelighed i den udviklede verden. En stor udfordring i lægemiddeludvikling er identifikationen af cellulære assays, der nøjagtigt rekapitulere normal og syge menneskers myocardial fysiologi in vitro. Ligeledes er de store udfordringer i regenerativ hjerte biologi centreret omkring identifikation og isolering af patient-specifikke kardiale progenitorer i klinisk relevante mængder. Disse celler skal derefter blive samlet til funktionelt væv, der ligner det native hjertevæv arkitektur. Microcontact printing muliggør etablering af præcise micropatterned protein figurer, der ligner den strukturelle organisering af hjertet, hvilket giver geometriske signaler til kontrol af celleadhæsion rumligt. Heribeskriver vi vores fremgangsmåde til isolering af højtoprensede myocardiale celler fra pluripotente stamceller differentiering in vitro, produktionen af cellevækst overflader micropatterned med ekstracellulære matrix-proteiner, og samlingen af stamceller celleafledte hjertemuskelceller til anisotrop myokardievæv.
Introduction
Trods de seneste fremskridt inden for medicinsk behandling, er fremskreden hjertesvigt en førende årsag til sygelighed og dødelighed i den udviklede verden. Det kliniske syndrom skyldes et tab af funktionel myocardievæv og efterfølgende en manglende evne af det svigtende hjerte til at opfylde metaboliske krav ramte individer. Da hjertet har en begrænset regenerationsevne, autolog hjerte transplantation er den eneste nuværende klinisk accepterede behandling direkte rettet mod genopfyldning tabt funktionel hjerte væv. Væsentlige ulemper ved hjertetransplantation, herunder et begrænset antal donorhjerter og behovet for langvarig immunosuppressiv behandling, den udbredte anvendelse af denne terapi hinder. Som følge heraf har medicinsk terapi været grundpillen i behandlingen af patienter med hjertesygdomme. En stor udfordring i lægemiddeludvikling er identifikationen af cellulære assays, der nøjagtigt rekapitulere normal og sygt myocardial fysiologi in vitro.
Den nylige konvergens stamcellebiologiske og tissue engineering teknologi rejser nye lovende muligheder for hjerte-regeneration. Generering funktionel myocardievæv fra en vedvarende patientspecifik kilde ville være et stort fremskridt på området. Dette vil give mulighed for udvikling af sygdomsspecifikke cellulære assays for lægemiddeludvikling og opdagelse og vil danne grundlag for hjerte-regenerativ medicin. Humane embryonale stamceller (ES) celler og, mere væsentligt, menneskeskabte pluripotente stamceller (iPS) celler udgør en potentielt vedvarende patient-specifikke kilde ventrikulære progenitorceller og modne ventrikulære myocytter. Kombinationen af stamcellebiologiske og vævsmanipulering strategier behandler dette problem ved at generere funktionelle hjerte væv in vitro, som kan anvendes ved udviklingen af cellulære assays til opdagelse af lægemidler eller ved hjerte regenerative fremgangsmåder til behandling af fremskreden hjertesvigt.
_content "> En central udfordring i hjertets regenerering har været identifikation af en optimal celletype. En bred vifte af celler er blevet undersøgt 1, men til dato, selvom forskellige multipotente cardiogene forstadier fra forskellige kilder er blevet opdaget, at identificere en celle kilde, der opfylder kritiske krav såsom engagement den myogene celler skæbne, er opretholdelse af evnen til at ekspandere in vivo eller in vitro og sammensætning til en funktionel myocardievæv vist sig at være et centralt problem 2. Vi har tidligere beskrevet et dobbelt transgen murine system der muliggør isolering af højrenset populationer af engagerede ventrikulære progenitorer (CVP) fra ES-celler differentiering in vitro. er genereret for en hidtil ukendt dobbelt transgen mus, der udtrykker den røde fluorescerende dsRed protein under kontrol af en Isl1-afhængig enhancer af MEF2c genet og Den forbedrede grønt fluorescerende protein under kontrol afDen hjerte-specifikke Nkx2.5 enhancer. Baseret på denne tofarvet fluorescerende reportersystem, første og andet hjerteområdet progenitorer fra udviklingslande ES-celler kan isoleres ved hjælp af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) i overensstemmelse med deres ekspression af MEF2c og Nkx2.5 gener. CVP ligne hjertemyocytter baseret på ekspressionsmønstre af myocardial markører og strukturelle og funktionelle kvaliteter 3, hvad giver store løfter for hjertevæv regenerative formål.Selv om der har været mange fremskridt inden for tissue engineering, efterligne native cellulær arkitektur fortsat en vigtig udfordring. Konventionelle metoder til at håndtere denne udfordring omfatte podning biologiske eller syntetiske stilladser med celler in vitro. På grund af et antal ulemper af stilladser, herunder hurtig nedbrydning, begrænset fysiske og mekaniske stabilitet og lav celledensitet 1,4,5, har vi forsøgt at konstruere scaffold-less væv. AltHough hjerteceller kan ændre deres lokale mikromiljø ved sekretion af ekstracellulære matrixproteiner, de har en mere begrænset kapacitet til at organisere sig til stavformede hjertemyocytter i fravær af ekstracellulære signaler. Således er en skabelon, der giver celler at passende geografiske og biologiske signaler at komponere funktionel myocardievæv påkrævet. Microcontact udskrivning tager denne udfordring op ved at give en enkel og billig teknik til præcist at kontrollere celleform, organisation og funktion 6-8, som alle er afgørende for dannelsen af linie funktionel myocardievæv. Den omfatter anvendelsen af microtextured polydimethylsiloxan (PDMS) stempler med funktionen størrelser ned til 2 um 9, der muliggør aflejring af ekstracellulære matrixproteiner på PDMS substrater i præcise mønstre og dermed at påvirke celleadhæsion rumligt.
Heri foreslår vi at kombinere væv bioteknik teknologi med stamceller cell biologi til at generere anisotrope funktionel myokardievæv. Derfor har vi her vise vores nyligt offentliggjorte fremgangsmåde til følgende: (1) dannelse af micropatterned proteinoverflader på PDMS substrater ved microcontact trykning til frembringelse af en skabelon til aligned myocardievæv, (2) isolering af højrenset hjerte-progenitorer fra ES-celler differentiere in vitro, og (3) en kombination af begge teknikker til at danne linie funktionelle myokardievæv.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol, præsenterede vi en metode til at isolere oprensede populationer af cardiogene progenitorer og frø dem på micropatterned fibronectin substrater hvad gør dem med at tilpasse og tage en hjerte myocyt-lignende stang form. Normal cellulær organisation er kritisk for normal vævsfunktion 8,10, især til myocardialt væv. Hjertemyocytter er blevet vist at udvikle forbedrede mekaniske 11,12 og elektrofysiologiske egenskaber 11,13 ved dannelse anisotrope cellearrays. Idet h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev udført i en del ved Center for Nanoscale Systems (CNS), et medlem af National Nanotechnology Infrastructure Network (NNIN), som er støttet af National Science Foundation under NSF tildeling no. ECS-0.335.765. CNS er en del af Harvard University.
Materials
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
- Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
- Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
- Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
- Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
- Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
- Black, L. D., Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
- Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
- Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
- Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
- Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
- Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).
