Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

توليد الأنسجة الانحياز عضلة القلب من خلال طباعة وظيفية Microcontact

Published: March 19, 2013 doi: 10.3791/50288
Automatic Translation
1, 1,2
1Cardiovascular Research Center, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, 2Harvard Stem Cell Institute

Summary

توليد الأنسجة عضلة القلب الانحياز هو مطلب رئيسي لتكييف التطورات الحديثة في بيولوجيا الخلايا الجذعية لأغراض مفيدة سريريا. هنا نحن تصف نهج الطباعة microcontact لمراقبة دقيقة من شكل الخلية ووظيفتها. استخدام عالي النقاء السكان من الخلايا الجذعية الجنينية المستمدة الأسلاف القلب، ونحن توليد الأنسجة عضلة القلب ثم متباين الخواص الوظيفية.

Abstract

قصور القلب المتقدمة يمثل أحد أكبر التحديات التي لم تلب السريرية، والتي تنشأ من فقدان قابلة للحياة و / أو وظيفية بالكامل خلايا عضلة القلب. على الرغم من العلاج الدوائي الأمثل، وفشل القلب تمثل السبب الرئيسي للوفيات والمراضة في العالم المتقدم. ومن التحديات الرئيسية في تطوير العقاقير هو تحديد المقايسات الخلوية التي تلخص بدقة الطبيعي وعلم وظائف الأعضاء المريضة عضلة القلب الإنسان في المختبر. وبالمثل، فإن التحديات الرئيسية في مجال البيولوجيا القلب التجدد تدور حول تحديد وعزل المريض محددة الأسلاف القلب بكميات ذات الصلة سريريا. هذه الخلايا ثم يجب أن يتم تجميعها في الأنسجة الوظيفية التي تمثل العمارة المحلية أنسجة القلب. الطباعة Microcontact يسمح لإنشاء الأشكال الدقيقة البروتين micropatterned التي تشبه التنظيم الهيكلي للقلب، وبالتالي توفير العظة الهندسية للسيطرة على التصاق الخلايا مكانيا. هناوصفنا نهجنا لعزل خلايا عضلة القلب عالي النقاء من الخلايا الجذعية المحفزة التفريق في المختبر، وتوليد السطوح نمو الخلايا micropatterned مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية، والجمعية من الخلايا الجذعية المستمدة من خلايا عضلة القلب إلى نسيج عضلة القلب متباين الخواص.

Introduction

على الرغم من التطورات الحديثة في العلاج الطبي، قصور القلب المتقدمة لا يزال السبب الرئيسي للوفيات والمراضة في العالم المتقدم. متلازمة سريرية تنشأ من فقدان أنسجة عضلة القلب الوظيفية وبعد ذلك عدم قدرة القلب فشلها في تلبية مطالب الأيضية للأفراد المتضررين. منذ القلب لديه قدرة محدودة التجدد، ذاتي زرع القلب هو العلاج الوحيد الحالي قبلت سريريا تهدف بصورة مباشرة إلى تجديد أنسجة القلب فقدت وظيفية. عيوب كبيرة زرع القلب، بما في ذلك عدد محدود من قلوب المانحة والحاجة إلى المعالجة طويلة المدى مناعة يحول دون انتشار واسع لاستخدام هذا العلاج. ونتيجة لذلك، كان العلاج الطبي الدعامة الأساسية لعلاج المرضى الذين يعانون من أمراض القلب. ومن التحديات الرئيسية في تطوير العقاقير هو تحديد المقايسات الخلوية التي تلخص بدقة عضلة القلب الفيزيولوجيا العادية والمريضة في المختبر.

التقارب الأخير لبيولوجيا الخلية الجذعية والأنسجة تكنولوجيا الهندسة يثير سبل جديدة واعدة لتجديد القلب. وتوليد الأنسجة القلبية وظيفية من مصدر المريض محددة قابلة للتجديد تكون تقدما كبيرا في هذا المجال. هذا من شأنه أن يسمح لتطوير فحوصات الأمراض الخلوية محددة لتطوير العقاقير واكتشاف وسوف يضع الأساس للطب التجديدي القلب. الإنسان الجذعية الجنينية (ES) والخلايا، بشكل ملحوظ أكثر من ذلك، الإنسان الجذعية المحفزة التي يسببها الخلايا (آي بي إس) تمثل المتجددة يحتمل المريض محددة مصدر الخلايا الاصلية البطين والبطين myocytes ناضجة. الجمع بين علم الأحياء الخلايا الجذعية وهندسة الأنسجة استراتيجيات تعالج هذه المشكلة عن طريق توليد أنسجة القلب وظيفية في المختبر والتي يمكن استخدامها في تطوير المقايسات الخلوية لاكتشاف المخدرات أو في النهج التجديدي القلب لعلاج قصور القلب المتقدمة.

_content "> قد يشكل تحديا رئيسيا في تجديد القلب تحديد نوع الخلية المثلى. وقد تم دراسة مجموعة واسعة من A الخلايا 1، لكن حتى الآن، على الرغم من أن تم اكتشاف مختلف السلائف قلبية متعددة القدرات من مصادر مختلفة، وتحديد خلية المصدر الذي يلبي متطلبات الأساسية مثل الالتزام مصير الخلية عضلي، وقد ثبت صيانة القدرة على التوسع في الجسم الحي أو في المختبر، وتكوين الأنسجة وإلى عضلة القلب وظيفية مشكلة المركزية 2. لقد سبق وصفها نظام مزدوج الفئران المعدلة وراثيا تمكن من عزل عالي النقاء من السكان الأسلاف البطين الملتزمين (CVP) من خلايا ES التفريق في المختبر، ونحن ولدت رواية الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن ضعف البروتين الحمراء الفلورسنت dsRed تحت سيطرة محسن Isl1 التي تعتمد على الجينات وMEF2c وتعزيز بروتين الفلورية الخضراء الخاضعة لسيطرةوالقلب محددة Nkx2.5 محسن. بناء على هذا النظام لمدة الملونة مراسل الفلورسنت، والأولى والثانية من القلب الأسلاف مجال الخلايا الجذعية الجنينية النامية يمكن أن تكون معزولة عن طريق الإسفار خلية المنشط الفرز (FACS) وفقا لتعبيره من MEF2c والجينات Nkx2.5. CVP تشبه myocytes القلب استنادا إلى أنماط التعبير عن علامات عضلة القلب والصفات الهيكلية والوظيفية 3، ما يقدم وعدا كبيرا لأغراض التجدد القلب الأنسجة.

وإن كانت هناك العديد من التطورات في مجال هندسة الأنسجة، ومحاكاة العمارة الخلوية المحلية لا يزال يشكل تحديا رئيسيا. الأساليب التقليدية لمواجهة هذا التحدي وتشمل البذر السقالات البيولوجية أو الاصطناعية مع خلايا في المختبر. بسبب وجود عدد من العيوب من السقالات، بما في ذلك تدهور السريع، ومحدودية الاستقرار الفيزيائية والميكانيكية وانخفاض كثافة الخلايا 1،4،5، حاولنا لهندسة الأنسجة سقالة أقل. ALTهوغ خلايا القلب يمكن تعديل المكروية المحلية من إفراز البروتينات المصفوفة خارج الخلية، لديهم قدرة محدودة أكثر على تنظيم أنفسهم لmyocytes قضيب على شكل القلب في حالة عدم وجود إشارات خارج الخلية. وبالتالي، لا بد من القالب الذي يقدم العظة المكانية المناسبة الخلايا والبيولوجية لتكوين الأنسجة عضلة القلب وظيفية. الطباعة Microcontact يتناول هذا التحدي من خلال توفير تقنية بسيطة وغير مكلفة للسيطرة على وجه التحديد شكل الخلية، والتنظيم، وظيفة 6-8، وكلها حاسمة بالنسبة لجيل من الأنسجة الانحياز عضلة القلب وظيفية. ويضم استخدام الطوابع microtextured (PDMS) Polydimethylsiloxane مع أحجام تتراوح ميزة أسفل إلى 2 ميكرون 9 أن تمكين ترسب البروتينات المصفوفة خارج الخلية على ركائز PDMS في أنماط دقيقة وبالتالي تؤثر على التصاق الخلايا مكانيا.

هنا، نقترح الجمع بين الأنسجة تكنولوجيا الهندسة الحيوية مع سل الجذعيةL البيولوجيا لتوليد أنسجة عضلة القلب متباين الخواص الوظيفية. وفقا لذلك، علينا أن نبرهن هنا نهجنا نشرت مؤخرا ما يلي: (1) توليد الأسطح البروتين micropatterned على ركائز PDMS من الطباعة microcontact لتوليد نموذج للالأنسجة الانحياز عضلة القلب، (2) عزل عالي النقاء الأسلاف من القلب خلايا ES التفريق في المختبر، و (3) الجمع بين كل من التقنيات لتوليد الانحياز الأنسجة عضلة القلب وظيفية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ويمكن تقسيم البروتوكول لتوليد الانحياز الأنسجة عضلة القلب وظيفية إلى ثلاثة أجزاء رئيسية. لا يعتبر تصنيع سيد micropatterned باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة جزء من بروتوكول التالية ولكن يمكن أن تكون مصنوعة على أساس طريقة إنشاء 6.

1. طباعة Microcontact من [فيبرونكتين] على ركائز PDMS

  1. مزيج Sylgard 184 الاستومر PDMS (داو كورنينج) في قاعدة 10:1 إلى نسبة علاج وكيل وديغا الجمعية باستخدام مجفف للقضاء على أي فقاعات الهواء.
  2. علاج PDMS ضد سيد ملفقة من قبل مع 20 ميكرون واسعة و 2 ميكرون طويل القامة التلال، مفصولة تباعد ميكرومتر (20) ليوم 2 إما في درجة حرارة الغرفة أو 4 في ساعة 65 ° C للحصول على طوابع microtextured PDMS.

ينصح بشدة * علاج داخل مجفف للقضاء على أي فقاعات الهواء.

  1. تدور معطف PDMS على تغطية زلات الزجاج (على سبيل المثال22x22 ملم) في 5،000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة باستخدام المغطي سبين زمن التقاطر لإنتاج رقيقة وحتى PDMS ركائز سمك ميكرومتر 15.
  2. تنظيف الطوابع مع الايثانول 70٪ لإزالة الغبار والجسيمات الترابية. السماح لهم الهواء الجاف.

* يمكن استخدام طوابع عدة مرات، ومع ذلك، تجديد الطوابع PDMS على أساس منتظم ويوصى بسبب تآكل السطح مع مرور الوقت.

  1. طوابع مكان في البلازما البلازما الأنظف الإعدادية SPI II وعملية لمدة 1 دقيقة إلى 275 mTorr لتقديم السطوح PDMS ماء.

يجب أن يشاهد * العلاج البلازما الأكسجين. يمكن معالجة أوقات أطول يؤدي إلى تشقق المطاط الصناعي.

  1. تعقيم الطوابع مع الايثانول 70٪ لمدة 1 دقيقة. يجف بسرعة مع الهواء المضغوط.

* يجب أن يتم تنفيذ خطوات أخرى في خزانة السلامة البيولوجية للحفاظ على العقم.

  1. تغطية الأسطح مع القضاء Fibronectin الحل (50 ميكروغرام / مل في DDH 2 O). كثف السماح لها على الأقل 10 دقيقة.
  2. التخلص من حل [فيبرونكتين] من الطوابع وتجف بسرعة مع الهواء المضغوط.
  3. اقامة اتصال بين امتثالي الطوابع وركائز PDMS لمدة 2 دقيقة ثم اضغط بشدة.
  4. شطف مع ركائز micropatterned DDH 2 O. تخزينها في DDH 2 O لمدة أقصاها 2 أسابيع في 4 درجات مئوية ما لم يستخدم في البداية. متجر PDMS الطوابع في DDH 2 O.

2. صيانة المعدلة وراثيا الجنينية مزدوجة خطوط الخلايا الجذعية

الأولى، وإعداد وسائل الإعلام التالية للخلايا ES الماوس زراعة:

الماوس الجنينية الخلايا الليفية (MEF)-المتوسطة: Dulbecco في معدلة النسر متوسطة (DMEM)، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ES التمايز الخلوي أو الصف، 1٪ البنسلين الستربتوميسين-(P / S)

الخلايا الجذعية الجنينية (ESC)-المتوسطة: DMEM، 15٪ FBS ES خلية في الصف،1٪ لغير الأحماض الأمينية الأساسية (NEAA)، و 0.5٪ P / S، 0.2٪ عامل المثبطة اللوكيميا (LIF)، 0،0007٪ 2-المركابتويثانول (2-ME)

  1. معطف 6 وحات جيدة مع الجيلاتين 0.1٪ العقيمة في DDH 2 O والسماح لها كثف 15 دقيقة عند 37 ° C.
  2. إضافة MEFs من قسامة إذابة لPBS مل 50 في أنبوب مخروطي الشكل وأجهزة الطرد المركزي لهم في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق MEFs في MEF المتوسطة.
  3. بعد امتصاص الجيلاتين الرشفة، وMEFs الزائدة إضافة إلى الآبار. تسمح MEFs 1 يوم تعلق.

* وقسامة من يكفي MEFs 10 ملايين لوحات 6 جيدا 3.

  1. عندما MEFs يوليان، إضافة خلايا ES قسامة من إذابة لPBS مل 50 في أنبوب مخروطي الشكل وأجهزة الطرد المركزي لهم في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. خلايا ES resuspend في ESC المتوسطة وإضافتها إلى الآبار التي تحتوي على MEFs. خلايا ES الثقافة في ESC متوسطة حتى يتم التوصل إلى نقطة التقاء.

* عندما وصلت خلايا ES التقاء، والركض REQUلتجنب فرط IRED والحفاظ على المستعمرات الخلية ES.

  1. إعداد الخلايا الجذعية الجنينية لالركض. الرشفة ESC المتوسطة ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
  2. نضح PBS وإضافة 500 ميكرولتر من التربسين. عملية 3،5 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  3. ماصة الحل التربسين صعودا وهبوطا عدة مرات لكسر المستعمرات الخلية ES وتحييده مع 500 ميكرولتر من ESC المتوسطة.
  4. خلايا ES مرور وفقا لنسبة تريدها، على سبيل المثال نقل 33 ميكرولتر إلى أخرى بشكل جيد مع سبق إعدادها MEFs لمرور 1/30. الحفاظ على خلايا ES ESC في المتوسط.

* A نسبة مرور 30/1 يسمح خلايا ES للوصول إلى التقاء في غضون 3 أيام. خلايا ES مرور وفقا لجدول زمني الخاص في تمايز المختبر.

3. في التمايز المختبر المحورة جينيا الجنينية مزدوجة خطوط الخلايا الجذعية وعزل والبذر من الأسلاف القلب

أولا، إعداد followiوسائل الإعلام نانوغرام اللازمة لتمايز الخلايا في المختبر ES:

التكيف المتوسطة: متوسط ​​Iscove في Dulbecco معدلة ل(IMDM)، 15٪ FBS ES خلية في الصف، 1٪ NEAA، 0.5٪ P / S، 0.2٪ LIF، 0،0007٪ 2-ME

تمايز المتوسطة: IMDM، 15٪ FBS التمايز في الصف. 1 NEAA٪، 0.5٪ P / S، 0.35٪ من حامض الاسكوربيك 0.1M، 0،0007٪ 2-ME

  1. تبدأ في التمايز المختبر عندما خلايا ES وصلت التقاء. معطف الثقافة أطباق 10 سم مع الجيلاتين 0.1٪ العقيمة في DDH 2 O والسماح لها كثف 15 دقيقة عند 37 ° C.

* كن على علم مدة عملية التمايز في المختبر. يستغرق 8 أيام حتى يمكن عزل الأسلاف القلب. خطة التجارب وفقا لذلك.

  1. خلايا ES الحصاد كما كان من قبل. بعد امتصاص الجيلاتين الرشفة، الزائدة وإضافة ما يقرب من 1/3-1/2 ES التعليق الخلية لثقافة المعدةالأطباق التي تحتوي على التكيف والمتوسط. الخلايا الثقافة لمدة 2 ايام.

* اختر كمية الخلايا الجذعية الجنينية للتكيف وفقا لتجاربك.

  1. الحصاد تكييف الخلايا الجذعية الجنينية في أنبوب 50 مل المخروطية التي تحتوي على PBS باستخدام 1. 5 مل من التربسين. أجهزة الطرد المركزي الخلايا ES فصل في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق و resuspend لهم في متوسطة التمايز.
  2. جعل الهيئات مضغي الشكل (EBS) من الخلايا حوالي 1،000 انخفاض بنسبة 10 ميكرولتر في 15 سم الأطباق ثقافة استخدام ماصة متعدد القنوات. عكس لوحات والثقافة وEBS شنقا قطرات مقابل 2.5 أيام في 37 ° C.
  3. بعد 2.5 يوم، حمام سباحة EBS من 6-8 سم 15 طبق الثقافة في C. باستخدام التمايز المتوسطة والثقافة منهم لأيام أخرى 3،5 في 37 ° 1
  4. بعد أيام 3،5، وجمع EBS في أنبوب مخروطي 50 مل والسماح لهم تنزل الى القاع لحوالي 5 دقائق. تملق طاف وغسل EBS مع PBS العقيمة. اسمحوا EBS تغرق مرة أخرى إلى أسفل لapproximately 5 دقائق.
  5. فصل EBS من معالجتها مع 2. 5 مل من التربسين لمدة 2 دقيقة في حمام مائي عند 37 ° C تهز أنبوب بهدوء. ثم، إضافة 2. 5 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة إلى حل التربسين وماصة صعودا وهبوطا مع ماصة 10 مل تقريبا المصلية 8-10 مرات لكسر كتل الخلايا. تحييد التربسين مع 10 مل من العازلة FACS تحتوي على 7.5٪ FBS الخلايا أو التمايز الصف ES-0.01٪ ودابي في برنامج تلفزيوني.
  6. أجهزة الطرد المركزي في فصل EBS 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق و resuspend لهم في حوالي 1 مل من العازلة FACS. ماصة صعودا وهبوطا مع ماصة 1 مل تقريبا 8-10 مرات لكسر كتل الخلايا.

* إضافة FACS العازلة وفقا لكمية تقدر ب EBS فصلها. قد تتركز خلايا جدا جدا تسد خلال FACS والخلايا المركزة منخفضة جدا قد يطيل FACS الوقت دون داع.

  1. نقل الخلايا إلى أنبوب الجولة القاع العقيمة مع مصفاة الخلية 35 ميكرومتر للحصول علىتعليق خلية واحدة.
  2. خلايا ES نوع متباينة باستخدام قياس التدفق الخلوي FACSAria والحصول على تنقية سكان CVP.

* وضعنا استراتيجية متعددة الخطوات النابضة لعزل الخلايا الملونة عالي النقاء. وباختصار، فإننا البوابة الأولى على السعة مبعثر إلى الأمام (FSC-A) والسعة الجانب مبعثر (SSC-A) (الشكل 1A). وهذا يسمح لنا لفصل الخلايا من الحطام الخلوية كله. ونحن على بوابة FSC ثم-A-مبعثر إلى الأمام والعرض (FSC-W) (1B الشكل). وهذا يسمح لنا لعزل singlets خلية من الحلل والمجاميع الخلوية الأخرى. ونحن على بوابة SSC ثم-A-مبعثر والجانبية العرض (SSC-W) (الشكل 1C). هذا يزيد من نقاء singlets الخلية. ونحن على بوابة ثم تلوين دابي لعزل خلايا قابلة للحياة (دابي سلبية) غير قابلة للحياة من الخلايا (1D الشكل). ونحن على بوابة السعة ثم Phycoeryhthrin (PE-A) وPE-Cyanine صبغ 7 السعة (PE-Cy7-A) للحصول صحيح الحمراء الإيجابية (R + - الخلايا) واستبعاد autofluorescent الحمراء السلبية الخلايا (الشكل 1E). R + R و- الخلايا هي بوابات ثم بشكل منفصل على السعة ثيوسيانات فلوريسئين (FITC-A) وPE-A لفرز صحيح الخضراء إيجابية (G +) وصحيح الخضراء السلبية (G -) + الخلايا داخل هؤلاء السكان (الشكل 1F 1G). هذه النتائج في 4 السكان من الخلايا كما يلي: R + G +، R + G -، R - G + R و- G - (الشكل 1H).

  1. إيقاف فاعلية micropatterned ركائز مع بلورونيك 1٪ F-127 في DDH 2 O لمدة 10 دقيقة. ثم، يغسل لهم 3x مع PBS العقيمة.

* بلورونيك F-127 هو بالسطح أن خلية التصاق القطع. انها تؤيد الحبس من التصاق الخلية إلى منطقة micropatterned.

  1. جوانات إرفاق PDMS منقوشة في المنطقةواضغط بشدة. CVP ثم البذور، وعلى ركائز micropatterned [فيبرونكتين].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كشفت FACS لتنقية الخلايا من في المختبر ES متباينة 4 السكان متميزة من الأسلاف (الشكل 1). وأكد وجود [فيبرونكتين] micropatterned بواسطة المجهر المناعي أن عرض كاملة من خطوط نقل [فيبرونكتين] مستمرة (الشكل 2). أدى الطلاء من FACS معزولة الأسلاف على micropatterns [فيبرونكتين] في محاذاة G + R + وجزء من R - G + السكان. على الرغم من بلورونيك F-127 كما تم استخدام مانع داعمة للالتصاق الخلية، و+ R G - R و- G - لم لا تحترم السكان العمارة متباين الخواص من [فيبرونكتين] ونما في الفضاء بين خطوط البروتين المجاورة (الشكل 3).

الشكل 1
الشكل 1. Represe ntative مخطط التدفق الخلوي من يوم 6 خلايا في المختبر ES متباينة. (A) الصب على السعة مبعثر إلى الأمام (FSC-A) والسعة الجانب مبعثر (SSC-A). (B) الصب على FSC A-(وإلى الأمام مبعثر بين العرض FSC-W). (C) الصب الصب على (D) SSC-A-مبعثر والجانبية العرض (SSC-W). على تلطيخ دابي. (E) المحاصرة لPhycoeryhthrin (PE) وصبغ PE-Cyanine 7 (PE- Cy7) (F G و) المحاصرة لسعة ثيوسيانات فلوريسئين (FITC-A) وPE-A (H) التدفق الخلوي الكشف عن مؤامرة 4 السكان متميزة من الأسلاف:. R + G +، R + G - G + -، R وR - G - اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

fig2.jpg "بديل =" الشكل 2 "/>
الشكل 2. المجهر المناعي ممثل ركائز [فيبرونكتين] micropatterned. شريط مقياس، 80 ميكرومتر.

الشكل 3
الشكل 3. المجهر المناعي ممثل الجنينية-(A) والخلية المستمدة ES-(B) FACS معزولة الأسلاف بعد 5 أيام إضافية الثقافة على micropatterns [فيبرونكتين] النواة، الأزرق؛ smMHC، الحمراء؛ sarcomeric α-actinin والأخضر. شريط النطاق، 40 ميكرومتر. مستنسخة من دميان وآخرون (2009).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول، قدمنا ​​طريقة لعزل السكان تنقيته من الأسلاف قلبية والبذور منها على ركائز [فيبرونكتين] micropatterned ما يسمح لهم التوفيق واتخاذ شكل قضيب خلية عضلية قلبية مثل. منظمة الخلوية العادية أمر بالغ الأهمية من أجل وظيفة الأنسجة الطبيعية 8،10، ولا سيما بالنسبة للأنسجة عضلة القلب. وقد ثبت myocytes القلب لتطوير 11،12 الميكانيكية والخصائص الكهربية تحسين 11،13 عند تشكيل خلية صفائف متباين الخواص. منذ الأسلاف القلب مثقف على ركائز [فيبرونكتين] micropatterned تفرق في الخلايا على شكل قضيب عضلة القلب في المختبر، فإن ذلك يمثل خطوة apivotal داخل أنسجة القلب الهندسة الحيوية.

الطباعة Microcontact هو أداة بسيطة وغير مكلفة التي يمكن استخدامها لتوليد 2-الأبعاد قوالب تشبه نسيج عضلة القلب في المختبر. ومع ذلك، الزخرفة كفاءة ونجاح المقتطفالبروتينات المصفوفة ellular يعتمد بشكل حاسم على البروتين في الاختيار. في حين تم مجموعة كبيرة ومتنوعة من البروتينات المختلفة ختمها بنجاح على ركائز PDMS، بروتينات معينة، مثل نوع الكولاجين الأول، تتطلب تعديل السطح من ركائز PDMS قبل الطباعة microcontact 14. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للكمية الضغوط التي مورست على الطابع وكذلك مدة ختم أيضا تؤثر بشكل كبير على كفاءة والإخلاص للطباعة microcontact.

آخر خطوة حاسمة في هذا البروتوكول هو استخدام المكنسة البلازما لجعل أسطح الطوابع PDMS ماء. هل من المعروف أن الطباعة microcontact لا تحدث عند كل من الطوابع PDMS وركائز لا تخضع الأكسجين العلاج البلازما 15، وعدة مجموعات وجدت ما هو مطلوب ضبط wettability من ركائز PDMS من أجل جعل عملية نقل البروتين من الممكن 3،6 ، 15. ومع ذلك، وجدنا أن زيادة hydrophilicity منPDMS قضاء بدلا من النتائج الركيزة PDMS في micropatterns البروتين أكثر اتساقا مع أعلى جودة، مثل خطوط البروتين أقل تعطيلا أو غير كاملة.

لبروتوكول المقدمة، تم اختيار micropattern عرض 20 ميكرون، وفقا لعرض الخلية المبلغ عنها myocytes الفئران حديثي الولادة القلب 16. ومع ذلك، ينبغي أن يتم تلفيق من micropatterns في نوع والقلب التنموية بطريقة 16-20 مرحلة التي تعتمد من أجل منع آثار عكسية على بقاء الخلية بسبب المساحة المحدودة.

اكتشاف وتنقية الخلايا المشتقة من CVP ES، ولا سيما + R + G السكان، وتمكين دراسات موثوق بها داخل النسيج الهندسة الحيوية في القلب. والجدير بالذكر أن لاحظنا دينا ES الخلية المستمدة من الأسلاف القلب لتكون قادرة على تشكيل أنسجة عضلة القلب التعاقد مع الحفاظ على اتساقها الخلوية. بالنظر إلى أن بناء ثلاثية الأبعاد الوظيفيةالأنسجة هو الهدف الرئيسي في مجال الهندسة الحيوية الأنسجة، يمكن أن لدينا ثنائي الأبعاد متباين الخواص ولدت الأنسجة عضلة القلب الاستخدام الفعال للأوراق طبقة الخلايا متعددة، ومجموعات أخرى سبق وصفها لأنواع الخلايا الأخرى 21،22. ومع ذلك، حتى الآن، واحدة قيد من نظام مراسل المعدلة وراثيا هو نتيجة للتمايز في المختبر من خلايا ES. FACS CVP المتاحة، ولا سيما قلبية بقوة R + G + السكان، حساب حاليا لمدة متوسطها 0.5٪ التقريبية لجميع الخلايا المتمايزة. وبالتالي، تحسين التمايز في المختبر من خلايا ES CVP في خطوة رئيسية نحو توليد كميات كافية من CVP لبناء الأنسجة أكبر متباين الخواص القلب تتكون من ألياف عضلة القلب محاذاة طوليا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

Acknowledgments

تم تنفيذ هذا العمل في جزء في مركز نظم النانومترية الحجم (CNS)، وهو عضو في شبكة تقنية النانو البنية التحتية الوطنية (NNIN)، وهو مدعوم من قبل مؤسسة العلوم الوطنية NSF تحت أي جائزة. ECS-0335765. CNS هو جزء من جامعة هارفارد.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A4544 Prepare 0.1M solution in ddH2O
Desiccator, Vacuum 10 inch Nova-Tech International, Inc. 55206
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Life Technologies D1306
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Scientific SH30022.01
DPBS Gibco 14190
FACSAria II Flow Cytometer BD Biosciences
Fetal Bovine Serum ES cell-grade Gemini Bio-Products 100-106
Fetal Bovine Serum Differentiation-grade Gemini Bio-Products 100-500
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F4759 Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O
Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm Fisher Scientific 12-548-B
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890 Prepare 0.1% solution in ddH2O
Headway Spin Coater Headway Research, Inc. PWM32-PS-CB15
Iscove's Modified Dulbecco's Medium Thermo Scientific SH30228.01
Leukemia Inhibitory Factor Self-prepared from LIF-secreting cell lines Prepare 500x stock solution
MEM Non-Essential Amino Acids Gibco 11140-050
2-Mercapt–thanol Sigma-Aldrich M6250
Mouse Embryonic Fibroblasts Harvested from day 12-15 mouse embryos
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 Prepare 1% solution in ddH2O
Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer BD Biosciences 352235
SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner SPI Supplies 11005-AB
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Vacuum Gauge SPI Supplies 11019-AB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
  2. Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
  3. Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
  4. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, Suppl . 4. 467-479 (2008).
  5. Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
  6. Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
  7. Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
  8. Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
  9. Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
  10. Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
  11. Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
  12. Black, L. D. 3rd, Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
  13. Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
  14. Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
  15. Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
  16. Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
  17. Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
  18. Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
  19. Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
  20. Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
  21. Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
  22. Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).

Tags

بيولوجيا الخلايا الجذعية، العدد 73، الهندسة الحيوية، والهندسة الطبية الحيوية، والطب، علم الأحياء الجزيئية، علم الأحياء الخلوي، علم التشريح، علم وظائف الأعضاء وهندسة الأنسجة، وأمراض القلب، بيولوجيا الخلية والخلايا الجذعية الجنينية، المجالس الاقتصادية والاجتماعية، Micropatterning والطباعة Microcontact، محاذاة الخلية، الأسلاف القلب،
توليد الأنسجة الانحياز عضلة القلب من خلال طباعة وظيفية Microcontact
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Atmanli, A., Domian, I. J.… More

Atmanli, A., Domian, I. J. Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing. J. Vis. Exp. (73), e50288, doi:10.3791/50288 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter