Isolation, Kultur og funktionel karakterisering af Voksen Mouse Cardiomyoctyes

Summary

Her beskrives isoleringen af ​​voksne mus cardiomyoctyes bruger Langendorff perfusion system. De resulterende celler er Ca2 +-tolerante elektrisk hvilende og kan dyrkes og transficeres med adeno-eller lentivirus at manipulere genekspression. Deres funktionalitet kan også analyseres ved hjælp af MMSYS systemet og patch clamp teknikker.

Abstract

Brugen af ​​primære cardiomyocytes (CMS) i kultur har givet et stærkt supplement til murine modeller af hjertesygdomme i at fremme vores forståelse af hjertesygdom. Især har evnen til at studere ionhomeostase, ionkanalfunktion, cellulær ophidselse og excitation-kontraktion kobling og deres ændringer i syge forhold og ved sygdomsfremkaldende mutationer ført til betydelige indsigt i hjertesygdomme. Desuden har manglen på en passende udødeliggjort cellelinje til at efterligne voksne CMS og begrænsningerne i neonatal CMS (som mangler mange af de strukturelle og funktionelle biomekanik karakteristisk for voksen CMS) i kultur hæmmet vores forståelse af det komplekse samspil mellem signalveje, ionkanaler og kontraktile egenskaber i den voksne hjerte styrke vigtigheden af ​​at undersøge voksne isolerede cardiomyocytes. Her præsenterer vi metoder til isolering, kultur, manipulation af genekspression ved adenovirus-EXPREssed proteiner og efterfølgende funktionel analyse af kardiomyocytter fra den voksne mus. Brugen af disse teknikker vil bidrage til at udvikle mekanistisk indsigt i signalveje, der regulerer cellulær ophidselse, Ca ^{2 +} dynamik og kontraktilitet og give en langt mere fysiologisk relevant karakterisering af hjertekarsygdomme.

Introduction

Murine modeller af hjerte-kar-sygdom har tjent som effektive værktøjer til afdækning grundlæggende sygdomsmekanismer ^1,2 samt for at identificere potentielle terapeutiske mål ^1,3. Især har brugen af både murine modeller af erhvervet hjertesygdom (såsom tryk-overload) ^4,5 og transgene musemodeller avancerede vores forståelse af hjertesygdom ^6-8. Anvendelsen af cellekulturteknikker at studere signalleringskaskader ^3,9,10 og ændringer i de enkelte proteiner, der ligger til grund for cellulær excitabilitet og excitation-kontraktion kobling i hjertet ^11-13 på niveau med enkelt celle har suppleret in vivo musemodeller. Imidlertid har manglen på passende cellelinjer, der afspejler voksen CM struktur og funktion været en betydelig begrænsning. Forskere har forsøgt at løse dette ved at studere individuelle proteiner, såsom ionkanaler i heterologe ekspressionssystemer <sup> 14, og mens disse undersøgelser har givet os med nyttige oplysninger i form af ionkanal-biofysik eller protein menneskehandel, utilstrækkelig repræsentation af indfødte mikromiljø CMS er en væsentlig begrænsning. For det andet, da de fleste af disse heterologe celler ikke har en moden kontraktile apparat, det har ikke været muligt at undersøge kontraktile funktion og den komplekse vekselvirkning mellem cellulær excitabilitet og sammentrækning. Af denne grund har vendte forskerne til primære cardiac cellekulturer til mange af deres in vitro funktionelle studier. Endelig isolerede cardiomyocyte undersøgelser muliggøre vurdering af kontraktile funktion uden forstyrrende faktorer i flercellede forberedelse inklusive effekten af ​​ar eller fibrose og fiber orientering.

Primære neonatale rotte ventrikulære cardiomyocytter (NRVMs), er forholdsvis let at kulturen kan være inficeret med adenovirus og lentivirus at manipulere genekspression ^15, ennd har derfor været anvendt med succes ^1, men har begrænsninger af deres egne. Selv om de giver en fysiologisk mikromiljø ¹ og har været arbejdshest af signalsystemet feltet væsentlige forskelle mellem morfologi og subcellulære organisering af NRVMs og voksne cardiomyoctyes gør dem en utilstrækkelig model for undersøgelse af ioniske strømme og excitation-kontraktion kobling i den voksne hjerte . Mest bemærkelsesværdigt NRVMs mangler en endelig t-rørformet delsystem ^4. Da Ca ^{2 +} flux og dynamik er kritisk afhængige af moden t-rørformet og sarcoplasmic reticulum (SR) struktur ^6, Ca ^{2 +} dynamik og funktionelle studier af hjertets kontraktilitet i NRVMs er ikke en nøjagtig afspejling af disse kritiske processer i voksne cardiomyocytes. Yderligere nogle komponenter i signalveje varierer mellem neonatale og voksne mus ^9, hvilket giver en anden begrænsning for at studere sygdomsprocesser og deres iVIRKNING på cellulær ophidselse og kontraktilitet i NRVMs. Endelig fordelingen af ​​kontraktile maskiner fører til flerstrenget og uensartet celle afkortning begrænser nøjagtigheden af ​​kontraktile målinger.

Brugen af isolerede voksne cardiomyocytes giver derfor et mere præcist in vitro modellering system. Den ekstraordinære stigning i viden muliggjort af genetisk manipulation af mus understreger betydningen af ​​at opnå funktionelle isolerede kardiomyocytter fra mus. Faktisk har karakterisering af voksne CMS isoleret fra musemodeller kaste lys over mange biologiske og patologiske begivenheder. Isolerede CMS transgene musemodeller har tilladt for undersøgelser af gevinst eller tab af funktion af proteiner på kontraktile egenskaber af enkeltceller ^2,16, og levedygtigheden i sygdomsmodeller såsom iskæmi / reperfusion ^17,18 og dermed supplere oplysninger fra de i vivo undersøgelser afSE mus. Brug af isolerede voksen CMS fra murine modeller af erhvervet hjertesygdom ^3,19,20 (såsom tværgående pulsåresammensnøring-induceret pres overbelastning, der efterligner hypertension eller aortaklappen stenose) eller motion ^5,21 (til modellering fysiologisk hypertrofi) giver mulighed for undersøgelse af samspillet mellem signaleringskaskader impliceret i disse processer med cellulær excitabilitet og excitation-kontraktion kobling ved niveauet for den enkelt celle. Endvidere evnen til at manipulere genekspressionen ved hjælp adenoviral drevet genekspression i voksen CMS giver os mulighed for at dissekere komponenterne i komplekse signaleringsveje.

Fra et elektrofysiologisk perspektiv har hel-celle spænding og strøm clamp eksperimenter på isolerede voksen CMS været afgørende at belyse karakteren af ​​ioniske flux ved baseline og i forskellige sygdomstilstande. På grund af den komplekse struktur af den cellulære membran og forskellen protei stilladser strukturer mellem voksen CMS og NRVMs eller heterologe cellelinjer, evnen til at lappe voksne celler giver en meget bedre repræsentation af virkningerne af visse membranproteiner, strukturelle proteiner og ionkanal-interagerende partnere på de elektrofysiologiske komponenter af den voksne hjerte.

Trods sådanne fremtrædende fordele i at studere voksne murine cardiomyocytes, isolere og dyrkning af voksne mus cardiomyocytes har været en udfordring, opfordrer behovet for en systematisk og præcis beskrivelse af metoden til at isolere levedygtige mus cardiomyocytter og at fastholde dem i kultur at tillade yderligere genetisk manipulation ved hjælp af viral vektorer. Tidligere undersøgelser har brugt enten akut isoleret mus voksen CMS eller kulturperler rotte voksen CMS. Sidstnævnte er lettere at kultur end voksen mus CMS, og de ​​fleste eksperimenter manipulere genekspression in vitro har anvendt rotte voksen CMS. Få studier har med succes ændret og undersøgt functiOnal genekspression i mus voksen CMS, præsentere en stor begrænsning i omfanget af eksperimenter. Derfor, her præsenterer vi i detaljer sådanne metoder, modificeret fra tidligere undersøgelser, til isolering ^7,8,22, kultur ^3,10,15,23, adenovirusinfektion ^11-13,15, og funktionel analyse af voksen mus ventrikulære cardiomyoctyes. Denne isolation protokol resultater i Ca ^{2 +-tolerante,} overgearet cardiomyocytter, som vi har med held dyrkes i op til 72 timer og kortvarigt transficeret med adenovirus. Funktionaliteten af disse isolerede celler kan vurderes ved hjælp af MMSYS imaging system ^14,24 og patch clamp, som også vil blive drøftet.

Protocol

1.. Cardiomyocyte Isolation Materialer (Figur 1) Microdissecting pincet Tissue pincet Sarte hæmostatiske pincet Hæmostatiske pincet Microdissecting, savtakkede, buede pincet Operating saks, lige Operating saks, buet 15 ml Falcon-rør (5) 60 mm petriskål Phosphatbufret saltvand (PBS) Nylon Mesh – 400 um porestørrelse Lille tragt Voks overtrukket, flettet silke 4-…

Representative Results

Isoleringen af voksne cardiomyoctyes resulterer i stavformede, riller og hvilende (ikke spontant slående) celler (figur 5A). Døde celler vil se afrundet og ingen riller vil være til stede. Hvilende celler kan dyrkes og transficeres med adenovirus at manipulere genekspression (figurerne 5B og 5C). Efter 24 timer af kultur, er morfologien af levende celler ikke ændres, er de stadig Ca2 +-tolerant, og de ​​kan tempo ved feltstimulering. Med den foreslåe…

Discussion

I denne rapport har vi beskrevet de teknikker, der er nødvendige for en vellykket isolering og dyrkning af voksne CMS musen hjerte. Vores teknik giver mulighed for efterfølgende undersøgelse af CM funktion og ophidselse hjælp af de metoder, der er beskrevet ovenfor. Den kritiske parameter for at studere funktionalitet voksen CMS sundhed og kvalitet af den isolerede CMS. Som beskrevet ovenfor vores teknikker giver mulighed for et højt udbytte af funktionelle celler, som er modtagelige for manipulation af genekspress…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S7653
Potassium Chloride	Sigma	P9333
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S8282
D-glucose minimum	Sigma	G8270
Taurine	Sigma	T0625
2,3-Butanedione monoxime	Sigma	B0752
Collagenase B	Roche Applied Science	11088807001
Collagenase D	Roche Applied Science	11088858001
Protease XIV from Streptomyces griseus	Sigma	P5147
Albumin from Bovine Serum	Sigma	A2153
Calcium Chloride	Sigma	C8106
Minimum Essential Media	Sigma	51411C
Albumin solution from bovine serum	Sigma	A8412
L-glutamine	Sigma	G3126
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I1884
Cesium Chloride	Sigma	289329
Glutamate	Sigma	G3291
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Sigma	E3889
Cesium Hydroxide Solution	Sigma	232041
Tetraethylammonium hydroxide solution	Sigma	86643
OptiVisor optical glass binocular visor	Dohegan Optical Company Inc.	N/A
Tissue forceps, 5.5″, 1×2 teeth	Roboz Scientific	RS-8164
Moloney forceps – 4.5″ (11.5 cm) long slight curve, serrated	Roboz Scientific	RS-8254
Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm	Roboz Scientific	RS-4966
Packer Mosquito Forceps 5″ Straight Flat	Roboz Scientific	RS-7114
Micro Dissecting Scissors 4.5″ Curved Sharp/Sharp	Roboz Scientific	RS-5917
Micro Dissecting Scissors 3.5″ Straight Sharp/Sharp20mm	Roboz Scientific	RS-5907