アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析
Summary
ここでは、ランゲンドルフ灌流システムを使用して、成体マウスcardiomyoctyesの単離を記載している。得られた細胞は、電気的に休止状態、のCa 2 +·トレラントであり、培養およびアデノ又は遺伝子発現を操作するためのレンチウイルスでトランスフェクトすることができる。それらの機能は、MMSYSシステムおよびパッチクランプ技術を用いて分析することができる。
Abstract
文化の中での一次心筋細胞（CMS）を使用すると、心臓病の理解を進める上で、心臓病のマウスモデルへの強力な補完を提供してきました。具体的には、疾患状態および疾患を引き起こす突然変異により、イオンホメオスタシス、イオンチャネル機能、細胞の興奮と興奮収縮連関とその変化を研究する能力は、心臓疾患に有意な洞察をもたらした。さらに、成人のCMを模倣するための適切な不死化細胞株の欠如、文化の中で（成人のCMの構造的および機能的生体力学特性の多くを欠いている）新生児のCMの制限は、シグナル伝達経路間の複雑な相互作用の理解を妨げている成人の心臓のイオンチャネルおよび収縮特性は、大人の孤立心筋細胞を研究することの重要性を強化する。ここでは、アデノウイルスexpreによる遺伝子発現の単離、培養、操作するための方法を提示するssedタンパク質、および成体マウスの心筋細胞のその後の機能解析。これらの技術の使用は、細胞の興奮性を調節する経路、Ca 2 +の動態及び収縮性をシグナルに機械的な洞察力を開発し、心血管疾患の多くの生理学的に関連する特性評価を提供するのに役立ちます。
Introduction
心血管疾患のマウスモデルは、潜在的な治療標的に1,3を識別するための基本的な病気のメカニズムの1,2の解明だけでなく、のための効果的なツールとして役立ってきた。具体的には、（例えば、圧力過負荷など）後天性心疾患の両方のマウスモデル4,5およびトランスジェニックマウスモデルの使用は、心臓病6-8の我々の理解を進めてきた。単一細胞のレベルで心臓11-13に細胞の興奮と興奮収縮連関の根底にある個々のタンパク質におけるシグナル伝達カスケード3,9,10及び変更を研究するための細胞培養技術の使用は、 インビボのマウスモデルを補完している。しかしながら、成人のCMの構造と機能を反映十分な細胞株の欠如は、重大な制限となっている。研究者らは、異種発現系において、イオンチャネルなどの個々のタンパク質を研究することによってこの問題を克服しようとしてきた<suP> 14、およびこれらの研究は、イオンチャネルの生物物理学やタンパク質輸送の面で有益な情報を提供してくれたが、CMのネイティブ微小環境の不十分な表現は重要な制限である。第二に、これらの異種細胞のほとんどが成熟した収縮装置を有していないので、収縮機能および細胞興奮性と収縮との間の複雑な相互作用を研究することは不可能であった。この理由のために、研究者は、それらのインビトロ機能的研究の多くで主要な心臓細胞培養物になっている。最後に、単離された心筋細胞の研究は、瘢痕または線維症と繊維配向の影響を含む多細胞調製物の交絡因子なしで収縮機能の評価を可能にする。
原発新生児ラット心室心筋細胞（NRVMs）が文化に比較的容易に、遺伝子発現15を操作するためにアデノウイルスおよびレンチウイルスに感染することができているNDしたがって首尾よく1使用されますが、自分自身の限界を持っているされています。これらは生理的微小環境1を提供し、シグナリング·フィールドの主力してきたが、形態およびNRVMsと大人のcardiomyoctyesの細胞内組織との間の実質的な違いは、彼らに大人の心の中のイオンフラックスと興奮収縮連関の研究には不十分モデルを作成。最も顕著なのはNRVMsは決定的なT-管状サブシステム4を欠いている。 Ca 2 +のフラックスとダイナミクスが成熟T-管状と筋小胞体（SR）構造6、Ca 2 +の動態とNRVMsにおける心収縮性の機能研究に決定的に依存しているので、成人の心筋細胞でこれらの重要なプロセスを正確に反映していない。さらに、シグナル伝達経路の一部のコンポーネントは、それによって病気のプロセスとそのIを研究するための別の制限を提供し、新生仔および成体マウス9の間で異なるNRVMs中の細胞の興奮と収縮性に対するMPACT。最後に、収縮機構の分布は、収縮測定の精度を制限する多方向不均一な細胞短縮につながる。
孤立した大人の心筋細胞の使用は、より正確なin vitroのモデル化システムを提供しています。マウスの遺伝子操作によって可能になった知識の驚くべき成長は、マウスから機能的な孤立心筋細胞を得ることの重要性を強調している。実際には、マウスモデルから分離され、成人のCMの特徴付けは、多くの生物学的および病理学的事象を解明しました。トランスジェニックマウスモデルから分離されたCMは、それによって中から得られた情報を補完し、そのような虚血/再灌流17,18として疾患モデルでのゲインまたはタンパク質の機能喪失単セル2,16の収縮特性上、及び生存率の研究を可能にした上のin vivo試験SEマウス。 （生理肥大をモデル化するための）や運動5,21検査のために可能にする（模倣高血圧や大動脈弁狭窄症は、そのような横方向の大動脈狭窄誘発の圧負荷など、）後天性心疾患3,19,20のマウスモデルから単離した成人のCMの使用単セルのレベルでの細胞の興奮と興奮収縮連関と、これらのプロセスに関与するシグナル伝達カスケードの相互作用の。さらに、成人のCMでアデノウイルス駆動性遺伝子発現を用いて遺伝子発現を操作する能力は、私たちの複雑なシグナル伝達経路の成分を分析する機会を与える。
電気生理学の観点から、全セル電圧および単離された成体のCMに電流クランプ実験は、ベースラインでのイオンフラックスの性質を解明することで、種々の疾患状態において重要であった。なぜなら、細胞膜の複雑な構造と差動proteの成人のCMとNRVMsまたは異種の細胞株の間に足場構造で、成人の細胞にパッチを適用する機能は、特定の膜タンパク質、構造タンパク質、および成人の心臓の電気生理学的コンポーネントのイオンチャネル相互作用パートナーの影響のより良い表現を提供します。
大人のマウスの心筋細胞を研究する上で、このような顕著な利点にもかかわらず、成体マウスの心筋細胞を分離して培養したウイルスを用いてさらに遺伝子操作を可能にするために実行可能なマウスの心筋細胞を分離し、培養液中で、それらを維持するための方法論の体系的かつ正確な説明の必要性を促し、挑戦しているベクトル。これまでの研究では、急性単離したマウスの成人CMSまたは培養したラットの成人のCMのいずれかを使用している。後者は、成体マウスのCMよりも文化に容易であり、in vitroでの遺伝子発現を操作するほとんどの実験は、ラット大人のCMを使用している。いくつかの研究が正常に変更し、functiをを調査した実験の範囲に大きな制約を提示し、マウスの大人のCMSのonal遺伝子発現。そこで、ここでは詳細に隔離7,8,22、文化3,10,15,23、アデノウイルス感染11-13,15、および成体マウスの心室cardiomyoctyesの機能解析のための以前の研究から変更などの方法を、紹介します。この分離プロトコル我々は、最大72時間のために正常に培養し、一過性にアデノウイルスでトランスフェクションしていたCa 2 +トレラント、興奮性心筋細胞における結果。これらの単離された細胞の機能は、説明するMMSYS撮像システム14,24およびパッチクランプを用いて評価することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、マウスの心臓から大人のCMの成功単離および培養のために必要な技術を説明しています。我々の技術は、上記の方法を用いてCM機能および興奮性のその後の研究を可能にする。大人のCMの機能性を研究するための重要なパラメータは、孤立したCMの健康と品質です。上述したように、我々の技術は、アデノウイルス/レンチウイルスの培養における感染、および細胞興奮性と収縮機能?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5″, 1×2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps – 4.5″ (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5″ Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5″ Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5″ Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
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