अलगाव, संस्कृति, और वयस्क माउस Cardiomyoctyes के कार्यात्मक विशेषता
Summary
यहाँ हम एक Langendorff छिड़काव प्रणाली का उपयोग कर वयस्क माउस cardiomyoctyes के अलगाव का वर्णन. जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं, + सहिष्णु विद्युत मौन सीए 2 हैं और सुसंस्कृत और एडिनो या जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने lentiviruses साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता. उनकी कार्यक्षमता भी MMSYS प्रणाली और पैच दबाना तकनीक का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है.
Abstract
संस्कृति में प्राथमिक cardiomyocytes (सीएमएस) के उपयोग को दिल की बीमारी के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने में हृदय रोग का murine मॉडल के लिए एक शक्तिशाली पूरक प्रदान की गई है. विशेष रूप से, कोढ़ की स्थिति में है और रोग के कारण परिवर्तन से आयन homeostasis, आयन चैनल समारोह, सेलुलर excitability और उत्तेजना संकुचन युग्मन और उनके परिवर्तन का अध्ययन करने की क्षमता हृदय रोगों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व किया है. इसके अलावा, संस्कृति में वयस्क मुख्यमंत्रियों की नकल करने की पर्याप्त अमर सेल लाइन की कमी है, और नवजात मुख्यमंत्रियों की सीमाओं (वयस्क सीएमएस के संरचनात्मक और कार्यात्मक बायोमैकेनिक्स विशेषता के कई कमी है), संकेत दे रास्ते के बीच जटिल परस्पर क्रिया के बारे में हमारी समझ के आड़े आती है आयन चैनल और वयस्क अलग cardiomyocytes का अध्ययन करने के महत्व को मजबूत बनाने के वयस्क दिल में सिकुड़ा गुण. यहाँ, हम adenoviral-expre द्वारा जीन अभिव्यक्ति का अलगाव, संस्कृति, जोड़ – तोड़ के लिए तरीके पेशssed प्रोटीन, और वयस्क माउस से cardiomyocytes के बाद कार्यात्मक विश्लेषण. इन तकनीकों का उपयोग सेलुलर excitability को विनियमित कि रास्ते, सीए 2 + गतिशीलता और सिकुड़ना संकेत में यंत्रवत अंतर्दृष्टि विकसित करने और हृदय रोग का एक बहुत अधिक physiologically प्रासंगिक लक्षण वर्णन प्रदान करने में मदद मिलेगी.
Introduction
हृदय रोग के murine मॉडल संभावित चिकित्सीय लक्ष्य 1,3 की पहचान करने के लिए मौलिक रोग तंत्र 1,2 elucidating के साथ ही के लिए प्रभावी उपकरण के रूप में सेवा की है. विशेष रूप से, (जैसे कि दबाव अधिभार के रूप में) का अधिग्रहण हृदय रोग के दोनों murine मॉडल 4,5 और ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग हृदय रोग 6-8 की हमारी समझ को उन्नत किया है. एकल कक्ष के स्तर पर दिल 11-13 में सेलुलर excitability और उत्तेजना संकुचन युग्मन कायम करना है कि व्यक्ति प्रोटीन में cascades संकेत 3,9,10 और परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए सेल कल्चर तकनीक के इस्तेमाल में vivo माउस मॉडल पूरित है. हालांकि, वयस्क मुख्यमंत्री संरचना और समारोह को प्रतिबिंबित कि पर्याप्त सेल लाइनों की कमी एक महत्वपूर्ण सीमा किया गया है. जांचकर्ता heterologous अभिव्यक्ति प्रणालियों में, इस तरह के आयन चैनल के रूप में व्यक्तिगत प्रोटीन का अध्ययन कर इस पर काबू पाने की मांग की है <sup> 14, और इन अध्ययनों आयन चैनल बायोफिज़िक्स या प्रोटीन की तस्करी, सीएमएस के मूल निवासी microenvironment के अपर्याप्त प्रतिनिधित्व के मामले में उपयोगी जानकारी के साथ हमें प्रदान की है, जबकि एक महत्वपूर्ण सीमा है. दूसरे, इन heterologous कोशिकाओं के अधिकांश एक परिपक्व सिकुड़ा तंत्र नहीं है के बाद से, यह सिकुड़ा समारोह और सेलुलर excitability और संकुचन के बीच जटिल परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए संभव नहीं रहा है. इस कारण से, शोधकर्ताओं ने अपने इन विट्रो कार्यात्मक अध्ययन से कई के लिए प्राथमिक हृदय सेल संस्कृतियों में बदल गया है. अंत में, अलग cardiomyocyte पढ़ाई निशान या फाइब्रोसिस और फाइबर के उन्मुखीकरण के प्रभाव सहित बहुकोशिकीय तैयारी के कारकों के बिना सिकुड़ा समारोह के मूल्यांकन की अनुमति.
प्राथमिक नवजात चूहे निलय cardiomyocytes (NRVMs) संस्कृति के लिए अपेक्षाकृत आसान है,, जीन अभिव्यक्ति 15 में हेरफेर करने adenoviruses और lentiviruses से संक्रमित हो सकते हैं कर रहे हैं एकएन डी इसलिए सफलतापूर्वक 1 इस्तेमाल किया, लेकिन उनकी खुद की सीमाएं हैं किया गया है. वे एक शारीरिक microenvironment 1 उपलब्ध कराने और संकेतन क्षेत्र के workhorse कर दिया गया है, आकारिकी और NRVMs और वयस्क cardiomyoctyes के subcellular संगठन के बीच काफी मतभेद हैं उन्हें वयस्क दिल में आयनिक अपशिष्टों और उत्तेजना संकुचन युग्मन की जांच के लिए एक अपर्याप्त मॉडल बनाने . सबसे विशेष रूप से NRVMs एक निश्चित टी ट्यूबलर उपतंत्र 4 की कमी है. सीए 2 + प्रवाह और गतिशीलता परिपक्व टी ट्यूबलर और sarcoplasmic जालिका (एसआर) संरचना 6, सीए 2 + गतिशीलता और NRVMs में हृदय सिकुड़ना के कार्यात्मक अध्ययन पर निर्भर हैं चूंकि वयस्क cardiomyocytes में इन महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं के एक सटीक प्रतिबिंब नहीं हैं. इसके अलावा, संकेत दे रास्ते के कुछ घटकों, जिससे एक और रोग प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए सीमा और उनके मैं प्रदान करने, नवजात और वयस्क चूहों 9 के बीच अलगNRVMs में सेलुलर excitability और सिकुड़ना पर mpact. अंत में, सिकुड़ा मशीनरी का वितरण सिकुड़ा माप की सटीकता सीमित multidirectional और गैर वर्दी सेल छोटा करने के लिए जाता है.
पृथक वयस्क cardiomyocytes के उपयोग इसलिए एक अधिक सटीक में इन विट्रो मॉडलिंग सिस्टम प्रदान करता है. चूहों के आनुवंशिक हेरफेर से संभव बनाया ज्ञान की असाधारण वृद्धि चूहों से कार्यात्मक अलग cardiomyocytes प्राप्त करने के महत्व को रेखांकित करता है. वास्तव में, माउस मॉडल से अलग वयस्क सीएमएस के लक्षण वर्णन कई जैविक और रोग की घटनाओं पर प्रकाश डाला गया है. ट्रांसजेनिक माउस मॉडल से अलग मुख्यमंत्रियों जिससे में से प्राप्त जानकारी के पूरक, ऐसे ischemia / reperfusion 17,18 के रूप में रोग मॉडल में लाभ या प्रोटीन के समारोह के नुकसान के एकल कक्षों 2,16 से सिकुड़ा गुणों पर, और व्यवहार्यता के अध्ययन के लिए अनुमति दी है पर vivo अध्ययनएसई चूहों. या (शारीरिक अतिवृद्धि मॉडलिंग के लिए) व्यायाम 5,21 परीक्षा के लिए अनुमति देता है (mimics उच्च रक्तचाप या महाधमनी वाल्व स्टेनोसिस कि इस तरह के अनुप्रस्थ महाधमनी कसना प्रेरित दबाव अधिभार के रूप में) का अधिग्रहण हृदय रोग 3,19,20 की murine मॉडल से अलग वयस्क सीएमएस का प्रयोग करें एकल कक्ष के स्तर पर सेलुलर excitability और उत्तेजना संकुचन युग्मन के साथ इन प्रक्रियाओं में फंसा cascades संकेत की बातचीत की. इसके अलावा, वयस्क मुख्यमंत्रियों में adenoviral संचालित जीन अभिव्यक्ति का उपयोग जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने की क्षमता हमें जटिल संकेत दे रास्ते के घटकों को काटना अवसर देता है.
एक electrophysiological दृष्टिकोण से, पूरे सेल वोल्टेज और पृथक वयस्क मुख्यमंत्रियों पर वर्तमान दबाना प्रयोगों आधारभूत पर आयनिक अपशिष्टों की प्रकृति elucidating में और विभिन्न रोग राज्यों में आलोचना की गई है. क्योंकि सेलुलर झिल्ली की जटिल संरचना और अंतर prote कीवयस्क सीएमएस और NRVMs या heterologous सेल लाइनों के बीच मचान संरचनाओं में, वयस्क कोशिकाओं पैच करने की क्षमता निश्चित झिल्ली प्रोटीन, संरचनात्मक प्रोटीन, और वयस्क दिल की electrophysiological घटकों पर आयन चैनल से बातचीत भागीदारों के प्रभाव का एक बेहतर प्रतिनिधित्व देता है.
, वयस्क murine cardiomyocytes का अध्ययन अलग और वयस्क चूहों cardiomyocytes चुनौती रहा है संवर्धन, व्यवहार्य माउस cardiomyocytes अलग करने के लिए और वायरल का उपयोग आगे आनुवंशिक हेरफेर की अनुमति के लिए संस्कृति में उन्हें बनाए रखने के लिए कार्यप्रणाली का एक व्यवस्थित और सटीक विवरण के लिए जरूरत के आग्रह में ऐसे प्रमुख फायदे के बावजूद वैक्टर. पिछले अध्ययनों तीव्रता से पृथक माउस वयस्क सीएमएस या सुसंस्कृत चूहे वयस्क मुख्यमंत्रियों या तो इस्तेमाल किया है. उत्तरार्द्ध वयस्क माउस सेमी की तुलना में संस्कृति के लिए आसान कर रहे हैं, और इन विट्रो में जीन की अभिव्यक्ति से छेड़छाड़ सबसे प्रयोगों चूहे वयस्क मुख्यमंत्रियों का इस्तेमाल किया है. कुछ अध्ययनों सफलतापूर्वक बदल दिया और कामकाज की जांच की हैप्रयोगों के क्षेत्र में एक बड़ी सीमा पेश माउस वयस्क मुख्यमंत्रियों में onal जीन अभिव्यक्ति,. इसलिए, यहाँ हम विस्तार से अलगाव 7,8,22, संस्कृति 3,10,15,23, adenoviral संक्रमण 11-13,15, और वयस्क माउस निलय cardiomyoctyes के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए पिछले जांच से संशोधित इस तरह के तरीके,, प्रस्तुत करते हैं. इस अलगाव प्रोटोकॉल हम अप करने के लिए 72 घंटे के लिए सफलतापूर्वक सुसंस्कृत और क्षणिक adenovirus साथ ट्रांसफ़ेक्ट है कि सीए 2 + सहिष्णु, उत्तेजनीय cardiomyocytes में परिणाम है. इन अलग कक्षों की कार्यक्षमता MMSYS इमेजिंग प्रणाली 14,24 और भी चर्चा की जाएगी जो पैच दबाना, का उपयोग मूल्यांकन किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस रिपोर्ट में, हम माउस दिल से सफल अलगाव और वयस्क सीएमएस की संस्कृति के लिए आवश्यक तकनीक का वर्णन किया है. हमारी तकनीक ऊपर वर्णित विधि का उपयोग कर मुख्यमंत्री समारोह और excitability के बाद अध्ययन के लिए अनुमति द…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5″, 1×2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps – 4.5″ (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5″ Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5″ Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5″ Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
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