Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie
Summary
Werkwijze voor de montage van lijm en oplosbaar gradiënten in een kamer microscopie voor levende celmigratie studies beschreven. De kunstmatige omgeving combineert aangroeiwerende oppervlakken en lijm tracks met oplossing hellingen en daarom maakt het mogelijk om te bepalen van het relatieve belang van begeleiding cues.
Abstract
Cellen kunnen voelen en migreren naar hogere concentraties lijm signalen zoals glycoproteïnen van de extracellulaire matrix en oplosbare signalen zoals groeifactoren. Hier beschrijven we een methode om tegengestelde hellingen van lijm en oplosbaar maken signalen in een microfluïdisch kamer, die verenigbaar is met live cell imaging. Een copolymeer van poly-L-lysine en polyethyleenglycol (PEG-PLL) wordt gebruikt om dekglaasjes passiveren en niet-specifieke adsorptie van biomoleculen en cellen voorkomen. Vervolgens microcontact printen of dip pen lithografie worden gebruikt om sporen van streptavidine de gepassiveerde oppervlakken creëren als verankeringspunten voor het gebiotinyleerde peptide arginine-glycine-asparaginezuur (RGD) als lijm cue. Een microfluïdische inrichting is geplaatst op het gemodificeerde oppervlak en gebruikt om de helling van lijm signalen (100% tot 0% RGD RGD) op streptavidine sporen. Tenslotte wordt dezelfde microfluïdische inrichting waarmee een gradiënt van een chemoattractant suc creërenh zoals foetaal runderserum (FBS), als de oplosbare cue in tegengestelde richting van de gradiënt van lijm signalen.
Introduction
Gerichte cel migratie is een fundamentele eigenschap van vele cellen en is een belangrijk aspect van veel normale fysiologische processen, met inbegrip van de embryonale ontwikkeling, afweer tegen infecties en wondheling. Bovendien celmigratie speelt ook een belangrijke rol bij veel ziekten zoals vasculaire ziekten, tumorcel metastase en chronische ontsteking 1,2. Terwijl de klassieke toestanden van celmigratie – polarisatie, uitsteeksel uitbreiding, de vorming van de hechting, de troepenmacht en achter retractie – worden algemeen aanvaard 3,4 is de opheldering van spatio-temporele mechanismen waardoor signaal integratie wordt gecoördineerd zo uitdagend.
De extracellulaire matrix (ECM) dient als substraat voor celadhesie en door inherente chemische en fysische 5 6 diversiteit voorziet directionele signalen te navigeren door cellen 7,8. Naast deze signalen lijm 9, oplosbare factoren 10-12 </> Sup zoals chemokines en groeifactoren kunnen induceren gericht cel migratie door chemoattractant receptoren en hun downstream motogenic signalering. Momenteel is niet bekend of betrokkenheid en signalering door adhesie receptoren (bijvoorbeeld integrinen) of chemoattractantia zoals receptor tyrosine kinase (RTK), dominant zijn. Evenmin is bekend of hiërarchieën receptorsystemen zijn celtype specifiek.
Levende cellen microscopie geeft een schat aan informatie die niet toegankelijk is in bulk-assays en kan gecombineerd worden met microfluïdische apparaten om gradiënten van geïmmobiliseerd 13,14 en oplosbare signalen 15 16 genereren. De hier beschreven methode maakt gebruik van een reeks eenvoudige en bepaalde stappen voor de oppervlaktebehandeling in combinatie met een commercieel verkrijgbaar microfluïdische ruimte een beeldvormend assay maken voor celmigratie die gemakkelijk kan worden geïmplementeerd in een laboratorium celbiologie (figuur 1). De geassembleerdemicrofluïdische apparaat optische eigenschappen die vergelijkbaar zijn met glas 17 en de gradiënten van diffundeerbare moleculen stabiel gedurende tenminste 16 uur. Het systeem kan gebruikt worden voor epifluorescentie microscopie en geavanceerde technieken. In tegenstelling tot andere chemotaxis opstellingen 18, is dit systeem geschikt voor het opnemen langzaam migreren hechtende cellen. Belangrijk is het systeem modulair en eenvoudig kan de invoering van alternatieve kleefstof of oplosbare migratie signalen en onderzoek van verschillende celtypen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol hebben we gebruik gemaakt van een in de handel verkrijgbare microfluïdische apparaat (sticky-Slide Chemotaxis 3D van Ibidi) om de effecten van chemisch gemodificeerde oppervlakken en chemoaantrekkende hellingen op celmigratie te bestuderen. Deze microfluïdische setup vereist geen stroom omdat de gradiënt wordt bepaald door diffusie langs de lengte van het kanaal. Dit is belangrijk omdat stroom kunnen verschillend beïnvloeden langzaam migrerende cellen zoals fibroblasten die stabiel focale …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de financiering van de Australian Research Council en de National Health en Medical Research Council van Australië en ook graag de dank Australian National Fabrication faciliteit voor de SU-8 meester voor de microcontact afdrukken. SHN wordt ondersteund door het Ministerie van Hoger Onderwijs Maleisië en Universiti Sains Maleisië.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
| Oven | Binder | ED 53 series | |
| Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4″ diameter, 500 μm, single side polished |
| GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
| PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
| Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
| Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
| Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
| Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
| Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
| 200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
| Vaseline | Sigma | 16415 | |
| Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
References
- Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
- Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
- Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
- Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e., Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).
- Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
- Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).
- Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).
- Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
- Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
- Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
- Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
- Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).
- Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
- Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
- Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
- Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
- Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
- Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
- Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
- Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).
