GST-صاحب تنقية: A خطوتين تقارب بروتوكول تنقية استسلام كامل طول البروتينات تنقية
Summary
في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود نطاق صغير طريقة تنقية البروتين كفاءة عالية وفعالة من حيث التكلفة، والذي يسمح تنقية البروتينات المؤتلف من خلال الجمع بين فريد شطورة GST-علامة وصغيرة صاحب العلامة.
Abstract
فحوصات أساسية في علم الإنزيمات لتوصيف البيوكيميائية من البروتينات في المختبر يتطلب تركيزات عالية من البروتين المنقى من الفائدة. يجب بروتوكولات تنقية البروتين الجمع بين الكفاءة والبساطة والفعالية من حيث التكلفة 1. هنا، نحن تصف طريقة GST-باعتباره صاحب الصغيرة الحجم نظام لتنقية تقارب جديدة للبروتينات المؤتلف، استنادا إلى N-محطة الجلوتاثيون سيفاروز الوسم (GST) وعلامة 2،3 10xHis-C المبنى رقم 4، وكلاهما تنصهر للبروتين من الفائدة. يتم استخدام بناء الأخير لتوليد مراقبة الحشرات، لإصابة Sf9 الخلايا المصابة للتعبير البروتين 5. GST هو علامة طويلة نوعا ما (29 كيلو دالتون) والذي يعمل على ضمان كفاءة التنقية. ومع ذلك، فإنه قد تؤثر على الخصائص الفسيولوجية للبروتين. وبالتالي، يتم لاحقا المشقوق قبالة البروتين باستخدام انزيم PreScission 6. من أجل ضمان أقصى قدر من النقاء وإزالة GST المشقوق، ونحنوأضاف خطوة تنقية تقارب الثانية على أساس صغيرة نسبيا صاحب العلامة. الأهم من ذلك، ويستند أسلوبنا على اثنين من العلامات المختلفة المرافقة طرفي البروتين، والذي هو أداة فعالة لإزالة البروتينات المتدهورة، وبالتالي، يثري البروتينات كامل طول. طريقة المقدمة هنا لا يحتاج إلى الإعداد فعال مكلفة، مثل FPLC. بالإضافة إلى ذلك، ونحن دمج MgCl 2 و ATP يغسل لإزالة الشوائب الحرارة بروتين الصدمة والعلاج نوكلياز لإلغاء تلويث الأحماض النووية. وباختصار، فإن مزيج من اثنين من الكلمات المختلفة المرافقة N-و-C محطة والقدرة على تنشق مرة واحدة من العلامات، وضمانات الانتعاش من البروتين العالية النقاء وطول الكامل من الاهتمام.
Introduction
تنقية البروتينات المؤتلف أمر حاسم لمعالجة المسائل الأساسية في الكيمياء الحيوية. الطرق التقليدية لتنقية البروتين مثل التبادل الأيوني اللوني وحجم الاستبعاد اللوني تعتمد على الخصائص الفيزيائية للبروتين الهدف مثل نقطة تساوي الكهربية وتهمة أو حجم، على التوالي. ويجري تقاسم خصائص البروتين الأخير من قبل مجموعة متنوعة من البروتينات، مما يزيد بشكل كبير من فرصة تلويث البروتينات في تنقية البروتين الاستراتيجيات التقليدية. يمكن الالتفاف على هذه المشكلة مع استخدام الأعمدة تنقية متعددة، والتي تستغرق وقتا طويلا. في نفس الوقت، وأساليب اللوني الأخيرة مطالبة الإعداد التجريبية مكلفة. تنقية تقارب علامة يزيد بشدة المستهدفة التحديد، كما هو الحال في معظم الحالات سوف يكون علامة فريدة من نوعها لبروتين من الفائدة. في الدراسات الحديثة، وقد استخدم على نطاق واسع تنقية العلم أو HA-تقارب.
وعلى النقيض من تفصيل القائمةombinant بروتوكولات تنقية البروتين التي تستخدم به واحد، أنشأنا مزيج فريد من اثنين من العلامات. ينطوي أسلوبنا الانصهار من علامة GST في N-محطة وصاحب العلامة في محطة سي من البروتين من الفائدة، لالنسبة المثلى بين كمية ونقاء البروتين المطلوب. ضريبة السلع والخدمات هو علامة طويلة (29 كيلو دالتون)، والتي هي ذات كفاءة عالية لتنقية على الجلوتاثيون الخرز سيفاروز. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام GST يضمن فعاليتها من حيث التكلفة لدينا أسلوب 1. إمكانية يلتصق قبالة GST مع انزيم PreScission (مع تسلسل الاعتراف LeuGluValLeuPheGln / GlyPro، مما أدى إلى إضافة اثنين فقط من الأحماض الأمينية) والعديد من المزايا، على سبيل المثال، فإن هذه الاستراتيجية يتجنب التعديلات وظائف البروتين الفسيولوجية بسبب عائق تفارغي. الصغير صاحب العلامة تنصهر مع غيرها من أقصى البروتين يخدم في خطوة تنقية الثانية لزيادة البروتين النقاء بغسل قبالة GST المشقوق، وكذلك البروتينات وغيرها من تدهور الملوثات. بالإضافة إلى ذلك، لا يتطلب البروتوكول خطوة لغسيل الكلى عند التبديل من ضريبة السلع والخدمات إلى صاحب تنقية خطوة العمود (راتنج تالون). الملوثات شيوعا في مثل هذه العمليات هي تنقية الحرارة صدمة البروتينات (HSP). إضافة خطوة الحضانة مع MgCl 2 و ATP يسمح إزالة هذه الملوثات (الشكل 1).
البروتين سريع اللوني السائل (FPLC) وعالية الأداء اللوني السائل (HPLC) هي التقنيات الشائعة التي تعتمد على الأجهزة باهظة الثمن لتوليد عالية الغلة من البروتين المنقى من الفائدة. بروتوكول تنقية دفعة نقدم هنا، في المقابل، هو دليل ولا يتطلب الإعداد فعال مكلفة. يمكن التوصل إلى ارتفاع العائد من البروتين عن طريق التوسع في البروتوكول. في نفس الوقت، مع بروتوكول تنقية دفعة، ويمكن تعديل حجم شطف من أجل تعزيز تركيز البروتين، والتي لا تعطى مع FPLC أو HPLC.
ntent "> أيضا، مع دفعة GST-صاحب بروتوكول تنقية والبروتينات مع حجم المدى من 10-300 كيلو دالتون ~ يمكن تنقيته. واحدة من أكبر مزايا تعطى من حقيقة أن واحدا يمكن تنقية العديد من البروتينات في نفس الوقت ، على سبيل المثال، على حد سواء من النوع البري والبروتين متحولة. إن نجاح بروتوكول المعروضة تعتمد فقط على مستوى التعبير والذوبان من البروتين من الفائدة.Protocol
Representative Results
Discussion
إلى صاحب GST بروتوكول تنقية المعروضة هنا هي مناسبة لتنقية مجموعة واسعة من الأحجام من البروتينات المؤتلف: نحن تنقيته بنجاح لى RAD51 (41kDa)، piBRCA2 (120kDa)، PALB2 (130kDa)، ونسبة عالية من البروتين الوزن الجزيئي غير المستقرة الليشمانيا الطفلية: لي BRCA2 (125kDa) 6،9. وعلاوة على ذ…
Acknowledgements
نشكر آن ماري ديون-كوت للمناقشات التي تؤدي إلى تطوير الأسلوب. JK وRB هي FQNRT العلماء الدكتوراه، M.-MG هو باحث فانييه CIHR، وJ.-YM هو أحد كبار الباحثين FRSQ. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث لJY. M.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| E.Coli DH10Bac (competent) | Invitrogen | ||
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Invitrogen | ||
| Maxi Prep Kit | Qiagen | 12163 | Solution I and II |
| Ultra Pure Bluo-Gal | Gibco (Life) | 15519028 | |
| IPTG | Gibco (Life) | 15529019 | |
| Sf9 infected cells | ATCC | CRL-1711 | |
| PreScission enzyme | GE Healthcare | 27084301 | |
| Grace's infected medium supplemented | Gibco (Life) | 11605-094 | |
| Fetal Bovine Serum characterized | Hyclone | SH30396.03 | |
| P/S (Penicillin-Streptomycin) | Gibco (Life) | 15070-063 | |
| Glutathione Sepharose resin | GE bioscience | 17075605 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Talon resin | Clontech | 635504 | |
| Imidazole | BioShop | 288324 | |
| Gentamicin | Gibco (Life) | 15710064 | |
| Polyclonal GST-antibody | Production in house | ||
| Monoclonal 6X-His-antibody | Clontech | 631212 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dounce homogenizer (tight) | Wheaton | 357546 | |
| Sonicator (Fisher dismembrator) | Fisher | Model 150 | |
| Dialysis bag (50 mm) | Fisher Scientific | 2115217 |
References
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL. Trends Genet. 12, 209-210 (1996).
- Carr, S., et al. Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems. Vaccine. 18, 153-159 (1999).
- Armisen, P., et al. Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports. J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).
- Kuhn, S., Zipfel, P. F. The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins. Gene. 162, 225-229 (1995).
- Buisson, R., et al. Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).
- Filimonova, M. N., et al. Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism. Biochemistry. 62, 983-988 (1997).
- Thorslund, T., et al. The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).
- Genois, M. M., et al. Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum. Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).
- Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).
