마우스 폐 내피 표면 층의 생체 측정
Summary
내피 내피 / glycocalyx 표면 층은 이상적인 intravital 현미경을 사용하여 공부하고 있습니다. Intravital 현미경은 기술적 같은 폐 등 움직이는 장기에 도전하고 있습니다. 우리는 동시 brightfield 및 형광 현미경은 자유롭게 – 이동에 내피 표면 층의 두께를 추정하는 데 사용할 수 있습니다 방법을 보여줍니다<em> 생체 내</em> 마우스 폐.
Abstract
내피 glycocalyx은 혈관 내강을 늘어서 proteoglycans 및 관련 glycosaminoglycans의 층이다. 생체에서 glycocalyx은 내피 기능의 유지에 기여 상당한 내피 표면 층 (ESL)을 형성, 매우 충분한 것입니다. 내피 glycocalyx가 자주 체외에서 탈선 및 표준 조직 고정 방법 중에 손실 된 바와 같이, ESL의 연구는 intravital 현미경의 사용이 필요합니다. 폐포 microvasculature의 가장 대략적인 복잡한 생리에, 폐 intravital 영상은 이상적으로 자유롭게 움직이는 폐에 수행됩니다. 이러한 준비는하지만, 일반적으로 광범위한 운동의 유물로 고통 받고 있습니다. 우리는 자유롭게 움직이는 마우스 폐의 폐 가슴 intravital 현미경은 내피 표면에서 휘황 – 라벨 고분자 체중 dextrans의 ESL 제외 통해 glycocalyx 무결성을 측정하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 필요이 아닌 복구 수술 기법,동시 brightfield와 마우스 폐의 형광 이미징은 혼란 폐 부상을 일으킬 증거도없이 subpleural microvasculature의 길이 방향 관찰 할 수 있습니다.
Introduction
내피 glycocalyx은 혈관 intima 릴 proteoglycans 및 관련 glycosaminoglycans의 세포 층입니다. 생체에서 glycocalyx는 호중구 – 내피 유체 투과성 1 등의 내피 기능의 다양한 규제 상당한 내피 표면 층 (ESL)을 형성, 높은 수화입니다 접착 2, 유체 전단 응력의 3 mechanotransduction.
역사적으로, glycocalyx 인해 표준 조직 고정 및 처리 6시 배양 세포 준비 4, 5 및 저하에서의 aberrance에 무시받는되었습니다. 증가 사용 intravital 현미경의 7 (생체 현미경에 IVM) 건강과 질병 중 혈관 기능에 ESL의 중요성에 상승 과학적 관심과 일치하고 있습니다. ESL은 빛 현미경에 보이지 않는과 쉽게 표시 할 수 없습니다적혈구 응집 8 치명적인 폐 emboli (게시되지 않은 관찰)을 일으킬 수있는 형광 glycocalyx 바인딩 lectins의 성향에 주어진 생체. 여러 간접적 인 방법 따라서 예를 cremasteric과 창 자간 막 microcirculations 같은 비 이동 혈관 침대에서 ESL 두께 (및, 확장하여, glycocalyx 무결성)을 추론하기 위해 개발되었습니다. 이 기술은 내피 표면에서 내피 막 (microparticle 이미지 velocimetry 9)뿐만 아니라 부피가 큰, 휘황 – 라벨 혈관 마커 (예 : dextrans)의 배제의 측정에서 거리의 함수로 microparticle 속도를 순환의 차이의 측정을 포함 (dextran 제외 기술 10, 11). 이러한 기술 중 단 dextran 제외 시간에 하나의 시점에서 만들어진 측정에서 ESL의 두께를 추정 할 수 있습니다. 동시에에 brightfield 현미경 (폭을 사용하여 혈관 폭을 측정하여"눈에 보이지 않는"ESL)과 ESL에서 제외 혈관 추적의 형광 현미경의 clusive, ESL 두께는 혈관 폭 2 ~ 한 반 차이로 계산 될 수있다.
ESL 두께의 순간 측정의 사용은 폐 glycocalyx 연구에 적합합니다. 폐의 Intravital 현미경은 크게 폐와 심장 모션 아티팩트 주어진 도전입니다. 최근 진보 생체 12, 13에 마우스 폐의 고정을 허용하지만, 문제는 폐 정지 physiologic 미치는 영향에 관한 존재합니다. 폐 부동는 14 신호 감소 내피 질소 산화물, 호중구 부착 15 폐 부상 16에 모두 영향을 신호 경로와 연결되어 있습니다. 또한,의 고전 physiologic 개념에 따라 폐 유해한 전단 세력 ( "atelectrauma"소위)에 모바일 폐포를 둘러싼 노출의 지역의 고정,폐포 상호 의존성 17.
2008 년 Arata 타 부치, 볼프강 Kuebler와 동료는 자유롭게 움직이는 마우스 폐 18 intravital 현미경을 허용하는 수술 기술을 개발했다. 이 기법에서 발생하는 호흡기 유물은 brightfield과 형광 현미경의 동시 측정 등의 고속 이미지의 사용에 의해 무효가 될 수 있습니다. 순간 dextran 제외 이미징은 생체에서 자유롭게 움직이는 마우스 폐의 subpleural microcirculation에서 ESL의 두께를 측정하는 고용 할 수있는 방법을이 보고서에서, 우리는 자세히 설명합니다. 이 기술은 쉽게 함수 구체적으로 glycocalyx를 결정하기 위해 내피 표면에서 요소를 순환 제외 할 수 ESL 그대로의 능력을 수정할 수 있습니다. 우리는 최근에는 패혈증이 같은 전신 염증 질환 중 급성 폐 손상의 발전에 폐 ESL 무결성의 중요성을 결정하기 위해 이러한 기술을 사용했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
생체 현미경에서의 확장 사용과 일치, ESL의 상당한 크기뿐만 아니라 혈관 기능에 수많은 공헌을 모두 증가 감사가 있습니다. 이 새로운 데이터는하지만, 주로 전신 vasculature의 연구에서 파생됩니다. 사실, 폐에 생체 현미경의 사용 기술적으로 주어진 중요한 폐와 심장 모션 유물은, 도전하고 있습니다.
여러 최근의 기술 진보는 폐 microcirculation 12, 13에 int…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Drs 감사드립니다. Arata 타 부치와 intravital 현미경에 관한 교육을위한 볼프강 Kuebler (토론토 대학). 우리는 현미경 설계 및 구현에 도움을 앤드류 케이힐 (니콘 인스트루먼트)을 감사드립니다. 이 작품은 NIH / NHLBI 보조금 P30 HL101295와 K08 HL105538 (EPS로)에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various |
References
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