Indagine di polarizzazione dei macrofagi Utilizzando Bone Marrow macrofagi derivati
Summary
L'articolo descrive un semplice facilmente adattabile<em> In vitro</em> Modello per studiare la polarizzazione dei macrofagi. In presenza di GM-CSF/M-CSF, cellule staminali / progenitrici ematopoietiche del midollo osseo sono dirette nella differenziazione monocitica, seguita dall'attivazione M1 o M2. Lo stato di attivazione può essere seguita da cambiamenti antigeni di superficie cellulare, espressione genica e le vie di segnalazione cellulare.
Abstract
L'articolo descrive un adattamento prontamente semplice modello in vitro per studiare la polarizzazione dei macrofagi. In presenza di GM-CSF/M-CSF, cellule staminali / progenitrici ematopoietiche del midollo osseo sono dirette nella differenziazione monocitica, seguita dall'attivazione M1 o M2. Lo stato di attivazione può essere seguita da cambiamenti antigeni di superficie cellulare, espressione genica e le vie di segnalazione cellulare.
Introduction
Distinto da risposte infiammatorie classiche, macrofagi che infiltrano i tessuti spesso mostrano lo stato di attivazione polarizzato che gioca un ruolo cruciale nella regolazione delle funzioni fisiologiche del tessuto ospite 1-8. Dopo la stimolazione, l'attivazione dei macrofagi possono essere ordinati in classic (M1) e alternativi (M2) attivazione 2, 4, 9. Attivazione dei macrofagi M1 dipende da recettori Toll-like (TLR) e l'attivazione del fattore nucleare kappa B (NFκB) / c-Jun N-terminal chinasi 1 (JNK1), che porta alla produzione di citochine infiammatorie, come TNF-α e IL- 1β e l'attivazione di iNOS che si traduce in un aumento della produzione di specie reattive come ossido di nitruro (NO) 10, 11. In contrasto, M2 macrofagi attivazione reclute PPARy, PPARδ, o IL-4-STAT6 percorsi, portando a antinfiammatorio attivazione alternativa, (M2) che è associato con sovraregolazione di mannosio recettore CD206, e arginasi 1 (Arg1) 6, 12 – 14 </ Sup>.
Midollo osseo macrofagi derivati (BMDM) presentano un ideale modello in vitro per capire i meccanismi che controllano la polarizzazione dei macrofagi attivati 15. Specificamente, l'attivazione dei macrofagi M1 può essere indotta da lipopolisaccaridi (LPS) stimolazione, mentre la polarizzazione dei macrofagi M2 può essere indotta da IL-4 e / o IL-13. Mature del midollo osseo macrofagi derivati e macrofagi attivati possono essere identificati attraverso l'analisi di citometria a flusso per l'espressione di antigeni di superficie, tra cui CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 e CD86 9, 16, 17. Inoltre, i cambiamenti nella produzione di citochine e di vie di segnalazione cellulari connessi con polarizzazione dei macrofagi possono essere misurati mediante RT-PCR e western blotting, rispettivamente. In sintesi, il midollo osseo del topo macrofagi derivati possono servire da modello rilevante per studiare polarizzazione dei macrofagi in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Riportiamo qui una procedura semplice e facilmente adattabile in vitro per indurre attivazione dei macrofagi derivati da midollo osseo cellule progenitrici. Questa procedura può essere utilizzata per le indagini di meccanismi responsabili per la polarizzazione dei macrofagi. La purezza dei macrofagi maturi ottenuti usando questo protocollo medie 95-99%, e non necessita di ulteriori procedure di purificazione. Per studiare la funzione dei geni specifici di interesse nel contesto di polarizzazione macrofag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association (BGIA 7.850.037 al dottor Beiyan Zhou).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Thermo Scientific | SH30259.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Murine GM-CSF | PeproTech | 315-03 | |
| NH4Cl | StemCell Technologies | 7850 | |
| L-929 | ATCC | CCL-1 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 10 x PBS | Thermo Scientific | AP-9009-10 | |
| Anti-mouse CD11b-APC | eBioscience | 17-0112-81 | |
| Anti-mouse F4/80-FITC | eBioscience | 11-4801-81 | |
| Anti-mouse CD69-PE | eBioscience | 12-0691-81 | |
| Anti-mouse CD86-PE | eBioscience | 12-0862-81 | |
| Propidium Iodine | Invitrogen | P3566 |
References
- Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
- Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -. W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
- Saberi, M., Woods, N. -. B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
- Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -. H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
- Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
- Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
- Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
- Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
- Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
- Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
- Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
