Undersøkelse av Macrophage Polarisering Bruk Bone Marrow makrofager som stammer
Summary
Artikkelen beskriver et lett enkelt adaptiv<em> In vitro</em> Modell for å undersøke macrophage polarisering. I nærvær av GM-CSF/M-CSF, blir hematopoetiske stamceller / stamceller fra benmargen rettet inn i monocyttisk differensiering, etterfulgt av M1 eller M2 stimulering. Aktiveringsstatusen kan spores av endringer i celleoverflateantigener, genekspresjon og celle signalveier.
Abstract
Artikkelen beskriver et lett enkelt adaptiv in vitro modell for å undersøke makrofag polarisering. I nærvær av GM-CSF/M-CSF, blir hematopoetiske stamceller / stamceller fra benmargen rettet inn i monocyttisk differensiering, etterfulgt av M1 eller M2 stimulering. Aktiveringsstatusen kan spores av endringer i celleoverflateantigener, genekspresjon og celle signalveier.
Introduction
Forskjellig fra klassiske inflammatoriske responser, makrofager som infiltrerer vev ofte vise polarisert aktivering status som spiller en avgjørende rolle i å regulere vert vev fysiologiske funksjoner 1-8. Ved stimulering, makrofag aktivering kan bli sortert i klassiske (M1) og alternativt (M2) aktivering 2, 4, 9. M1 makrofag aktivering avhenger av Toll-lignende reseptorer (TLR) og aktivering av kjernefysiske faktor kappa B (NFκB) / c-Jun N-terminal kinase 1 (JNK1), som fører til produksjon av inflammatoriske cytokiner, for eksempel TNF-α og IL- 1β og aktivering av iNOS som resulterer i økt produksjon av reaktive oksygenforbindelser slik som nitride oksyd (NO), 10, 11.. I kontrast, M2 makrofag aktivering rekrutter PPARγ, PPARδ, eller IL-4-STAT6 pathways, som fører til alternative, anti-inflammatoriske (M2) aktivering som er forbundet med oppregulering av mannose-reseptoren CD206, og arginase 1 (Arg1) 6, 12 – 14 </ Sup>.
Benmarg avledet makrofager (BMDM) presenterer en ideell in vitro modell for å forstå mekanismene som styrer polarisering av aktiverte makrofager 15. Nærmere bestemt, kan aktivering av makrofager M1 bli indusert av lipopolysaccharides (LPS) stimulering, mens polarisering av M2 makrofager kan induseres ved IL-4 og / eller IL-13. Modne benmarg avledet makrofager og aktiverte makrofager kan identifiseres gjennom flowcytometri analyse for uttrykk for overflateantigenene, inkludert CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 og 9 CD86, 16, 17. I tillegg kan forandringer i celle-cytokinproduksjon og signalveier assosiert med makrofag polarisering bli målt ved kvantitativ RT-PCR og western blotting, henholdsvis. Oppsummert kan mus benmarg avledet makrofager fungere som en relevant modell for å studere macrophage polarisering in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi rapporterer her en enkel og lett tilpasses in vitro prosedyre for å indusere aktivering av makrofager som stammer fra benmargsstamceller. Denne prosedyre kan benyttes for undersøkelse av mekanismene som er ansvarlige for polarisering av makrofager. Renheten av modne makrofager innhentet ved hjelp av denne protokollen gjennomsnitt 95-99%, og ingen ekstra rensing må utføres. For å undersøke funksjonen av spesifikke gener av interesse i sammenheng med makrofag polarisering, ektopisk ekspresjon eller genet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association (BGIA 7.850.037 til Dr. Beiyan Zhou).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Thermo Scientific | SH30259.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Murine GM-CSF | PeproTech | 315-03 | |
| NH4Cl | StemCell Technologies | 7850 | |
| L-929 | ATCC | CCL-1 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 10 x PBS | Thermo Scientific | AP-9009-10 | |
| Anti-mouse CD11b-APC | eBioscience | 17-0112-81 | |
| Anti-mouse F4/80-FITC | eBioscience | 11-4801-81 | |
| Anti-mouse CD69-PE | eBioscience | 12-0691-81 | |
| Anti-mouse CD86-PE | eBioscience | 12-0862-81 | |
| Propidium Iodine | Invitrogen | P3566 |
References
- Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
- Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -. W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
- Saberi, M., Woods, N. -. B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
- Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -. H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
- Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
- Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
- Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
- Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
- Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
- Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
- Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
